转染smad3基因的大鼠肾系膜细胞upa及pai1表达的改变

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1、转染Smad3基因的大鼠肾系膜细胞uPA及PAI1表达的改变【关键词】系膜细胞Smad3尿激酶型纤溶酶原激活物纤溶酶原激活物抑制因子1［Abstract］Objective:ToelucidatethemechanismoftheroleofTGFβinthedevelopmentofglomerulosclerosisbyobservingurokinasetypeplasminogenactivator(uPA)andplasminogenactivatorinhibitor1(PAI1)expressionsoncultu

2、redratmesangialcells(MsC)transfectedad3cDNA.Methods：Lipofectinmethodad3cDNAintoratMsC,RTPCRandsC）有Smad2，Smad3和Smad4存在，可被TGFβ1激活并参与纤溶酶原激活物抑制因子1（plasminogenactivatorinhibitor1，PAI1）及Ⅰ型胶原的转录过程［3,4］。最近我们运用细胞转基因技术发现Smad7介导了肾小球MsC基质降解酶系统代谢过程，且其可能为阻止肾小球硬化发生的重要机制［5］。本实验将Smad3

3、cDNA重组质粒经脂质体介导转染大鼠MsC，观察转基因MsC克隆尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinasetypeplasminogenactivator,uPA)及PAI1的表达，以进一步阐明TGFβ介导肾小球硬化发生的作用机制。1材料和方法1.1重组Smad3真核表达质粒的鉴定与超纯质粒的制备pcDNA3.0Smad3（日本Dr.TakeshiImamuna馈赠）经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切及EcoRⅠ单酶切鉴定，送测序（联合基因公司）后大量扩增，QIAGENKit纯化。1.2Smad3基因对MsC转染和阳性细胞克隆的筛选实验用

4、MsC为第8代，其制备及鉴定可参阅已报道的常规方法［6］。融合生长的细胞以1×106细胞数转入6孔板内，到呈现30%～50%融合生长时，弃完全培养液，分别加含有Lipofectin(Gibcobrl公司)和pcDNA3.0Smad3或Lipofectin和pcDNA3.0混合液的无血清培养液（Sigma公司）1ml，20h后弃无血清培养液，加入含20%血清的完全培养液，72h后再改用含G418（600μg/ml，Gibcobrl公司）的完全培养液。20d后克隆形成，将其种入24孔板中，直至生长至融合，再转入6孔板，最后转入100ml培养瓶

5、中。1.3对含有Smad3MsC克隆的鉴定1.3.1RTPCR法阳性克隆细胞生长至亚融合时，用Trizol（Gibcobrl公司）抽提总RNA，反转录成cDNA（Promega公司）,等量cDNA依照AdvantagecDNAPCRkit(Clontech公司)提供的步骤进行PCR。其引物如下：内参照GAPDH（上游5′ACCACAGTCCATGCCATGCCATCAC3′;下游5′CCACCACCCTGTTGCTGTAG3′，预计扩增片段长度为450bp）。Smad3(上游5′TCTTGTGTCTAAGAGAGTTGA3′;

6、下游5′TCCAGTCCAGGAGAAAGGCAC3′，预计扩增片段长度为363bp)。1.3.2ad3多克隆抗体（1∶200，Oncogene公司），二抗为生物素化兔抗山羊IgG（1∶500，ABCKit）。1.4RTPCR法检测uPA与PAI1mRNA阳性细胞克隆生长至亚融合时，用Trizol（Gibcobrl公司）抽提总RNA，反转录成cDNA（Promega公司）,等量cDNA依照AdvantagecDNAPCRkit(Clontech公司)提供的步骤进行PCR。PCR引物如下：内参照GAPDH同上。uPA(上游5′AAT

7、CGAACTGTGGCTGTC3′;下游5′ATCCCTCTTTCTTCTCAAGG3′，预计扩增片段长度为406bp)。PAI1（上游5′CCTCTCCGCCATCACCAACA3′；下游5′TGTGCCGCTCTCGTTCACCT3′，预计扩增片段长度为261bp）。1.5Westernblot法检测uPA与PAI1蛋白阳性细胞克隆生长至亚融合时，弃完全培养液，PBS洗3次，取20μl蛋白依标准方法分别作8%SDSPAGE变性电泳，转移至PVDF膜。一抗分别为鼠抗人uPA多克隆抗体(1∶200，复旦大学朱运松教授馈赠

8、)及鼠抗人PAI1单克隆抗体(1∶200，Oncogene公司)，二抗分别为生物素化马抗鼠IgG（1∶500，ABCKit）。1.6定量和统计分析用KodakDigitalSc