电喷雾离子化多级质谱解析环孢菌素结构

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1、电喷雾离子化多级质谱解析环孢菌素结构陈振伟温耀明季新燕郑卫【摘要】应用电喷雾离子化多级质谱法分析四种环孢菌素同系物，并对它们的裂解规律进行分析归纳。在电喷雾离子化多级质谱条件下，环孢菌素先形成N端加质子的〔M+H〕+分子离子，然后沿肽链的酰胺键发生断裂，产生相应的碎片离子，开环裂解主要发生在2和3位、1和11位以及5位和6位氨基酸残基之间。这一裂解规律可应用于环孢菌素类化合物的快速结构鉴定。【关键词】电喷雾离子化多级质谱环孢菌素结构鉴定Structuralcharacterizationofcyclosporinsbyelectrospra

2、yionizationmassspectrometryABSTRACTElectrosprayionizationmassspectrometrymethodentationpatternsandstructuralassignmentsofcyclosporinsentalconditions,cyclosporinsfirstform〔M+H〕+ionbyabsorbingaprotonontheNatom,thentheamidebondsplitandaseriesoffragmentsformed.Themainfragmenta

3、tionpatharysplittingbetinoacidresidues23,111and56.ThecorrespondingNterminalbtypeionsonfragmenttypesinthemassspectra.Thefragmentationschemecouldbeusedforrapidaminoacidsequencedeterminationofcyclosporins.KEYassspectrometry;Cyclosporins;Structuralcharacterization环孢菌素是由真菌

4、产生的一组环状十一肽物质，其中环孢菌素A(CsA，Fig.1)已作为重要的免疫抑制剂广泛应用于器官移植时的抗排斥反应，此外，环孢菌素还具有多种其它重要的生物活性如免疫抑制、抗真菌、抗寄生虫、抗炎、抗HIV、逆转肿瘤细胞多药耐药、治疗I型糖尿病、疟疾、牛皮癣等作用〔1～3〕。目前已从其最初的产生菌雪白白僵菌(Beauveriabassiana)的代谢物中分离到了二十多个环孢菌素同系物，并在多达17种真菌的代谢产物中分离到各种环孢菌素类化合物〔1，4，5〕。筛选具有各种生物活性的新环孢菌素同系物已成为当今环孢菌素研发的一个热点，天然和半合成的环

5、孢菌素类化合物已超过800个，因此建立一种可以快速鉴别环孢菌素化学组成的方法显得尤为重要。由于环孢菌素类化合物为两端封闭的环状十一肽物质，不能直接用Edman降解法对其十一个氨基酸进行序列分析，因此，早期环孢菌素类化合物的结构鉴定多采用NMR、IR和MS以及x射线晶体衍射等方法进行，并结合强酸水解后测定分子中氨基酸含量的方法最终确定环状十一肽的序列，方法复杂繁琐〔6，7〕。自20世纪80年代以来生物质谱技术在蛋白质和多肽结构鉴定中的应用日趋成熟，对肽键断裂过程的研究表明肽键的断裂主要有b和y两种模式，在b模式中，电荷从N+转移到O+上，离子

6、生成在断裂肽键的C端，形成b离子；在y模式中，电荷不转移，发生氢重排，离子生成在断裂肽键的N端，形成y离子，如Fig.2所示。因此，可以利用质谱技术对短肽进行氨基Cs:AX=H,Y=CH3;B:X=Y=H;C:X=OH,Y=CH3;D:X=Y=CH3;H(DMeval11)CsA1993年Vladimir等报道了用快原子轰击(FAB)结合碰撞活化解离(collisionallyactivateddissociation，CAD)质谱方法分析环孢菌素的氨基酸序列，发现在快原子轰击质谱中先由一个质子加到环孢菌素的某个氨基氮上，形成〔M+H〕+

7、离子，然后沿肽链的酰胺键(如1和11位氨基酸之间的酰胺键)发生断裂，产生一系列短肽片段离子(即b离子)。对环孢菌素而言，最容易发生断裂的位置为1和11位氨基酸之间(b111)，2和3位氨基酸之间(b23)以及5和6位氨基酸之间(b56)，以环孢菌素A为例，其2和3位氨基酸之间酰胺键断裂的方式如Fig.3所示〔9〕。FAB结合CAD质谱方法能直接判断环孢菌素中十一个氨基酸的序列和组成，为环孢菌素类化合物的结构鉴定提供了一个快捷准确的分析方法。但是，FAB质谱方法还存在一些局限性，如分析过程中需要加入基质；由于采用单一高能量的轰击源(6k

8、V)，会产生许多非选择性，无规律的碎片离子峰，因此无法进行多级质谱(MSn)分析。20世纪80年代发展起来的电喷雾离子化(ESI)质谱目前已在天然产物的分子量测定和结构解析中得到