基质辅助激光解析电离质谱和电喷雾质谱共同快速确证达托霉素结构.pdf

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1、第43卷分析化学(FENXIHUAXUE)研究报告第1期2015年1月ChineseJournalofAnalyticalChemistry63～68DOI：10．11895／j．issn．02534820．140385基质辅助激光解析电离质谱和电喷雾质谱共同快速确证达托霉素结构黄亚娟张拓，韩治国，孟晓光，宋纯艳，刘曙晨郑俊杰魏开华“，，。(北京正旦国际科技有限责任公司，北京102206)(北京蛋白质组研究中心，蛋白质组学国家重点实验室，国家蛋白质科学中心(北京)，北京102206)(军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京100850)摘要运用基质辅助激光解析电离一飞行时间串联质谱(MALD

2、I—TOF／TOFMS)和电喷雾。四级杆．飞行时间质谱(ESI—Q—TOFMS)快速确证环脂肽达托霉素的结构。首先，ESI检测达托霉素相对分子量为1619．7107，与理论值偏差0．0007。选择其双电荷峰m／z809．848作为母离子进行ESI串联质谱(MS／MS)测定，成功匹配了达托霉素环外氨基酸序列C9H9CO—Trp—Asn—Asp。其次，优化LiOH裂解达托霉素的实验条件，以MALDI．TOF／TOFMS监测开环效果，获得95％以上的开环样本后，分别运用MALDI和ESI进行MS／MS测定，达托霉素开环产物的b和y全部被匹配，达托霉素全部氨基酸序列得到确证。最后，对开环产物的ESI—

3、MS／MS条件进一步优化，获得了丰富的低端碎片离子，解析了脂肪酸链结构，并绘制了脂肪酸链的裂解图。本方法快速、简便、准确，是确证环脂肽类化合物结构的可靠方法。关键词达托霉素；环脂肽；串联质谱；电喷雾质谱1引言达托霉素(Daptomycin)是从玫瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)发酵液中提取的一种新型环脂肽类抗生素，能迅速杀死绝大部分革兰氏阳性菌，并且在体外对已呈现甲氧西林、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强活性⋯。达托霉素分子式为C，：H。。N。O，含1个亲水核及1个亲脂尾J，它具有新颖的化学结构：4位苏氨酸(Threonine，Thr)的羟基与末尾13位

4、犬尿氨酸(Kynurenine，Kyn)的羧基生成酯键，形成含10个氨基酸的环肽；1位色氨酸(Tryptophan，Trp)的J7、r末端与十碳脂肪酸形成酰胺键，封闭了肽段的Ⅳ端；分子中包括3个非蛋白源的特殊氨基酸：鸟氨酸(Ornithine，Om)，3一甲基谷氨酸(3-Glutamicacid，3-mGlu)和KynJ。化学结构见图1。达托霉素的结构确证难点是需同时确证环肽的氨基酸序列和环上的脂肪酸链结构，尤其还包含多个非天然氨基酸。目前，国内对达托霉素的研究报道多集中在提取、分离、合成和抗菌活性上～]，未见对其结构鉴定。虽然，对其结构鉴定已有文献报道J，但是多采用核磁共振法，而核磁共振法具

5、有样品用量大、解谱复杂、分析时间长等缺点。近年来质谱技术得到了广泛图1达托霉素缮陶的应用和发展，基于软电离技术的ESI质Fig-Structureofdaptomycin谱和基质辅助激光解析电离质谱(MALDI—MS)是两种最常用的生物质谱，是蛋白质和多肽结构确证的重要手段。本研究利用MALDI和ESI质谱成功地对达托霉素进行了一级结构确认，方法简便、快2014-04-30收稿；2014-09-22接受本文系国家高技术研究发展计划863项目(Nos．2012AA020205，2014AA020906)、国家科技部传染病重大专项(No．2013ZX10002009—001-001)、国家重大科学

6、仪器设备开发专项(No．2012YQ18011710)资助}E·mail：wkh2006@126．com；jjzheng@sina．com分析化学第43卷速，可为环脂肽类抗生素药物结构分析提供参考。2实验部分2．1仪器与材料基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(MALDI—TOF／TOF)，micrOTOF—QⅡ质谱仪(Bruker公司)；注射泵(Harvard公司)；C一ZipTip脱盐柱(Millipore公司)。一氰基4一羟基肉桂酸(—CHCA，Fluka公司)；乙腈(ACN，Fisher公司)；三氟乙酸(TFA)和甲酸(FA)(Sigma公司)；LiOH(国药集团化学试剂有限公司)；达托

7、霉素(华北制药股份有限公司)；Milli—Q超纯水。2．2实验方法2．2．1样品直接ESI-MS／MS测定称取样品干粉适量配成0．01mol／L的样品溶液，取样品溶液15L，经ZipTip柱脱盐后，用0．1％FA溶液稀释到0．01g／L，用100L直喷进样。2．2．2样品开环及MS／MS检测取0．0lmol／L样品溶液l0L，加入90L0．025mol／LLiOH溶液，混匀，分别在20和25℃下反