草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定

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1、草鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其特性鉴定郝贵杰,沈锦玉,徐洋,姚嘉赟,潘晓艺【摘要】目的:研制抗草鱼免疫球蛋白IgM的单克隆抗体(mAb)并进行免疫学特性分析。方法:制备草鱼免疫球蛋白IgM,以其为抗原免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,3～4次免疫后取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,用ELISA法对杂交瘤进行筛选,并鉴定mAb的生物学特性。结果:各株阳性克隆经3次亚克隆后,共获得5株抗草鱼IgM的mAbs,分别命名为4B3、2B11、4D5、3F2和4E6,它们的细胞上清ELISA效价为1∶3200～1∶6400,其中4D5的细胞上清及腹水效价

2、分别为1∶6400和1∶256000,经亚类鉴定结果表明5株mAb均为IgG1。交叉反应结果表明5株mAb均不与台湾甲鱼、泰国甲鱼、日本甲鱼和中华鳖的血清反应,除mAb4B3外,其余4株均与草鱼、青鱼、鲢鱼、鳊鱼和花鱼骨的血清有明显的交叉反应,而与鲫鱼、鳗鱼的血清只有微弱的反应。mAb4B3只与草鱼和青鱼的血清有反应,而与其他鱼类血清反应很弱。免疫印迹实验结果表明mAb4D5能在变性条件下识别草鱼IgM的重链。ELISA检测mAb4D5对草鱼IgM的敏感性达10μg/L。结论:制备的抗草鱼IgMmAb可用于草鱼免疫球蛋白的结构分析、免疫应答水平监测

3、和病原诊断等,具有广阔的应用前景。【关键词】免疫球蛋白;间接ELISA;单克隆抗体;BALB/c小鼠草鱼(Ctenopharyngodonidellus)是一种草食性鱼类,饲养成本低,养殖地域广,具有悠久的养殖历史,是我国四大家鱼之一,其养殖对我国农业经济增长具有重要的意义[1]。但草鱼病害一直困扰该产业的发展,尤其是草鱼出血病危害最为严重,常引起草鱼鱼种及成鱼的大批死亡。要解决这些问题,除了加强管理、提高养殖技术外,还必须重视其病原学、免疫学等领域的研究,将免疫预防手段引入到草鱼养殖业,通过免疫手段有效增强鱼体主动防御能力,减少疾病的发生机率[2

4、]。然而对草鱼免疫学的研究还处于初始状态,王欣欣等[3]克隆并分析了草鱼免疫球蛋白分子重链cDNA的一些特性。李亚南[4]进行了嗜水产气单胞菌诱导的草鱼免疫球蛋白的分析,得出草鱼的免疫球蛋白主要是IgM,其单体的重链和轻链相对分子质量(Mr)分别为62000和26000。但未见到草鱼免疫球蛋白单克隆抗体(mAb)的研制和应用的报道。基于这种认识和生产上的需求,我们开展了草鱼免疫球蛋白mAb的研究,试图将mAb运用于草鱼Ig结构与功能的分析以及病原诊断学和免疫应答规律的研究。　　1材料和方法　　1.1材料草鱼体重1000～1500g,购自湖州某农贸市

5、场。8周龄雌性BALB/c小鼠及ICR小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。HT、HAT及高糖型DMEM购自Sigma公司;小牛血清购自杭州四季青生物工程有限公司。L谷氨酰胺(LG)购自上海实生细胞生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG购自华美生物工程有限公司。融合用PEG4000购自Sigma公司,邻苯二胺(OPD)购自华美公司,其他生化试剂均为国产分析纯试剂。　　1.2方法　　1.2.1免疫原的制备草鱼断尾取血,室温放置2h后,放入4℃冰箱过夜,使血清充分析出。次日收集血清,4℃离心15min以去除细胞和颗粒性物质。制备Sephade

6、xG200层析柱,柱长70cm,直径1.6cm。草鱼血清经50%饱合硫酸铵粗提,透析并浓缩后约4mL。用PBS(pH7.4)倍比稀释后,经0.45μm滤膜过滤后上样。用PBS洗脱,自动采样器收集洗脱液,并用紫外分光光度计跟踪测定洗脱液的蛋白浓度,最先洗脱的蛋白即为IgM。将第一个洗脱峰接收的蛋白合并并测定浓度置于-20℃冰箱保存备用。　　1.2.2动物免疫参照文献[5,6],取适当抗原与弗氏完全佐剂按1∶1的比例混合乳化,腹部皮下途径接种6～8周龄雌性BALB/c小鼠,抗原蛋白量约为100μg/只,初次免疫后2周,抗原与弗氏不完全佐剂混合乳化,同

7、法免疫。以后免疫不再加佐剂,分别在4周、6周后各加强免疫1次,融合前3d腹腔及尾静脉途径再加强免疫1次。　　1.2.3细胞融合细胞融合按常规方法[5,6],取免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0混合于融合管内,1000r/min,离心10min,弃去上清,轻振融合管底,使沉淀细胞松散均匀,置37℃水浴中预热。然后在45s内缓慢滴加预热的PEG4000溶液1mL,边加边轻转搅拌,然后在90s内缓慢加入不完全DMEM培养基,终止融合。静置10min后,1000r/min,离心10min,弃上清,加入HAT培养基,使细胞悬浮并混匀。加入适量饲养细胞分装至96孔细

8、胞培养板,放于60mL/LCO2培养箱内培养。第4～5天各孔补加1滴HAT培养液,第9～10天用HT培养液换出全部HAT培