奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用.pdf

《奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用.pdf》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、第28卷第1期大连海洋大学学报V01．28No．120i3年2月JOURNALOFDALIANOCEANUNIVERSITYFeb．2013文章编号：2095-1388(2013】O1一oo07一O5奥尼罗非鱼免疫球蛋白单克隆抗体的制备及其初步应用郝贵杰，潘晓艺，徐洋，姚嘉赘，尹文林，沈锦玉(浙江省淡水水产研究所，浙江湖州313001)摘要：采用饱和硫酸铵盐析和SephadexG一200柱层析方法制备奥尼罗非鱼Oreochromisniloticus~0．auFell,$(体质量为500—1000g)免疫球蛋白(IgM)，以其为抗原免疫8周龄的BALB／c小鼠，免疫3

2、～4次后，取小鼠脾细胞与SP2／0骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法对杂交瘤进行筛选。结果表明：阳性克隆经3次亚克隆后，共获得6株针对罗非鱼IgM的单克隆抗体(mAb)，分别命名为1CIO、1C2、1G11、2C2、2F9和4B3，所有单抗均为IgG类，各株杂交瘤的细胞上清ELISA效价为1：800～1：3200；制备4B3和1G11的腹水单抗，ELISA效价分别为1：102400和1：6400。免疫印迹试验结果表明，mAb4B3能在变性条件下识别罗非鱼IgM的重链，约在相对分子质量85000左右。用ELISA检测4B3对罗非鱼IgM的敏感性，IgM灵敏度为10L。利用

3、所制备的单抗4B3建立了评价无乳链球菌Streptococcusagalactiae灭活疫苗免疫罗非鱼血清抗体水平的三抗体夹心ELISA(TAS—ELISA)方法，结果表明：腹腔注射和浸泡免疫无乳链球菌灭活疫苗14d后，两种免疫方式的罗非鱼血清抗无乳链球菌的抗体比对照组稍有增加；免疫21d后，两种免疫方式的罗非鱼血清抗体均有明显增加；免疫35d后增加更为显著，达到最高峰，注射组效价达1：2560，浸泡组达l：640；免疫56d后抗体开始下降，直到第98天还维持在明显高于对照组的抗体水平。本研究表明，所制备的罗非鱼IgMmAb可用于评价罗非鱼疫苗免疫效果及抗体产生规律等

4、，具有广阔的应用前景。关键词：奥尼罗非鱼；免疫球蛋白；间接ELISA；单克隆抗体；BALB／c小鼠中图分类号：$965．125文献标志码：A奥尼罗非鱼Oreochrom~niloticusxO．aureus是养lin，Ig)介导的特异性免疫反应引。目前，国内殖罗非鱼的主要品种之一_1J。随着罗非鱼养殖业外对罗非鱼的菌苗免疫已进行了大量研究l1，的发展，罗非鱼病害有逐渐增多的趋势，特别是近但能够直接反映罗非鱼免疫球蛋白提高从而判断免年来两广地区及海南省罗非鱼养殖中出现了严重疾疫效果的试剂还很缺乏，而针对免疫球蛋白的单抗病，其病原主要有海豚链球菌Streptococcus

5、iniae和研究能够弥补这一缺失。有关罗非鱼免疫球蛋白无乳链球菌Streptococcusagalactiae。另外，多(IgM)的相关研究已有一些报道_1J，但有关罗种水生动物病原性链球菌已被证明可在高等动物非鱼IgM单克隆抗体(mAb)研制和应用的研究或／和人类间传播】。对罗非鱼链球菌病害的控尚未见报道。为此，本研究中作者开展了罗非鱼制目前仍以抗生素为主，长期使用抗生素可诱导耐IgMmAb的制备及其初步应用研究，以期为评价罗药菌产生，破坏养殖水体微生态环境，同时抗菌药非鱼链球菌灭活疫苗免疫应答水平及规律提供必要物残留也是影响水产品质量的重要因素。因此，研的试剂。制

6、疫苗进行预防显得尤为重要，通过免疫手段有效1材料与方法增强鱼体的主动防御能力，减少疾病发生的机率]。研究证实，鱼类在受到微生物感染或人1．1材料工免疫后，均能产生由免疫球蛋白(Immunoglobu-试验用奥尼罗非鱼体质量为500—1000g，购收稿日期：2012-05-01基金项目：浙江省湖州市科技攻关计划项目(2010C21107)作者简介：郝贵杰(1979一)，助理研究员。E—mail：melissa511@sina．com通信作者：沈锦玉(1963一)，女，研究员。E-mail：sjinyu@126．tom8大连海洋大学学报第28卷自湖州某农贸市场。ICR小鼠

7、和8周龄雌性BALB／1)菌苗的制备及罗非鱼的免疫。罗非鱼无乳C小鼠购自浙江大学医学院实验动物中心。链球菌L4灭活疫苗的制备参照文献[25]中的方罗非鱼无乳链球菌L4由中国水产科学研究院法，由中国水产科学研究院鱼病研究室制备。于试鱼病研究室保存，BHI(脑心浸液培养基)购于杭验前两周，选取同一批健康的奥尼罗非鱼，体质量州天和公司，小牛血清购自杭州四季青生物工程材为40～60g(购自衢州某奥尼罗非鱼种苗场)。在料有限公司，高糖型DMEM及HT、HAT购自Sig—过滤的池塘水中充氧饲育，水温为2O～22℃。试ma公司，HRP羊抗鼠一IgG、邻苯二胺(OP