val、ile及leu对必特螺旋霉素生物合成的影响

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1、Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响作者：李桢林江维王永红*郝玉有储炬庄英萍张嗣良【摘要】在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响，证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸，发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异，而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快，达到1.0g/(L·h)，胞内丙酮酸积累，

2、丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%，柠檬酸合成酶活性降低41%，发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象，最终效价比对照高出45.3%，而总异戊酰组分则降低了23%，其他酰化组分降低了39.6%；添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%，柠檬酸合成酶活性降低了47%，发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%，而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大，异戊酸在胞外积累，随后被重新

3、吸收利用，最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%，效价和对照基本一致。【关键词】必特螺旋霉素；缬氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；有机酸；铵离子ABSTRACTThispaperdemonstratedthatsupplementingvaline(L-Val),isoleucine(L-Ile)andleucine(L-Leu)insyntheticmediahaddifferenteffectsonbiosynt

4、hesisofmulti-ponentsofbiotechspiramycin.Theresultsshoentof0.05g/100mlaminoacidsafter36hoffermentationresultedindifferentpHvaluesandammoniumionconcentrationsoffermentationbroth,and2to3time-increaseoftheactivityofvalinedehydrogenase.gSO40.55，NaCl1.0，CaCO

5、30.5。(3)培养条件将1ml甘油管接种于一级摇瓶，28℃培养48～56h，按10%接种量接种于二级种子摇瓶中，28℃培养24～26h，按8%接种量接种于发酵摇瓶(装液量50ml/500ml)中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。每天定时取样测定各种发酵代谢参数，测定结果为3个样的平均值。(4)氨基酸添加方式称取一定重量的Val、Leu和Ile在紫外灯下照射12h，并于发酵进行到36h时分别在不同的摇瓶中添加0.05g/100ml的Val、Ile、Leu。1.2试剂和仪器乙酸、丙酸、丙

6、酮酸、丁酸和异戊酸均为分析纯；Val、Leu、Ile、牛血清白蛋白为生化试剂；色谱仪为AgilentHP1100(检测器：G1314A紫外可见波长检测器；进样器：G1328A)；酶标仪为ThermoMK3(ElectronCorporation)。1.3测定方法(1)生物量测量采用测量菌丝干重法(Drycelll发酵液，过滤后用蒸馏水洗菌体，连同滤纸于80℃烘至恒重后称量。(2)总糖、还原糖测定采用斐林试剂法［9］。(3)铵离子浓度测量采用Berthelot比色法［10］。(4)以杯碟法［8］测生物

7、效价，乙酰螺旋霉素为标准品，枯草芽孢杆菌作为鉴定菌。(5)产物组分以及胞外有机酸测定。HPLC法测定有机酸乙酸、丙酸、丙酮酸和α-酮戊二酸色谱柱：AquaSep(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(98.5∶1.5)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。丁酸和异戊酸色谱柱：Shim-packVP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用Na

8、H2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(60∶40)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。HPLC分析发酵样品取必特螺旋霉素发酵液于3000r/min离心10min，取上清液于-20℃冷冻保存备用。分析时取1ml上清液l0000r/min离心10min，上清液用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空过滤后，取20μl进样。按照2.4Val、Ile及Leu对胞外短链脂肪酸前体的影响必特螺旋霉素是由短链脂肪酸单体经聚酮合成酶头尾缩合而成。