val、ile及leu对必特螺旋霉素生物合成的影响论文

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1、Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响论文李桢林江维王永红*郝玉有储炬庄英萍张嗣良【摘要】在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响，证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸，发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异，而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快，达到1.0g/(L·h)，胞内丙酮酸积累，丙酮酸羧化酶活性增加20%～95

2、%，柠檬酸合成酶活性降低41%.freelonstratedthatsupplementingvaline(L-Val),isoleucine(L-Ile)andleucine(L-Leu)insyntheticmediahaddifferenteffectsonbiosynthesisofmulti-ponentsofbiotechspiramycin.Theresultsshoentof0.05g/100mlaminoacidsafter36hoffermentationresultedindifferentpHvalues

3、andammoniumionconcentrationsoffermentationbroth,and2to3time-increaseoftheactivityofvalinedehydrogenase.gSO40.55，NaCl1.0，CaCO30.5。(3)培养条件将1ml甘油管接种于一级摇瓶，28℃培养48～56h，按10%接种量接种于二级种子摇瓶中，28℃培养24～26h，按8%接种量接种于发酵摇瓶(装液量50ml/500ml)中，220r/min，28℃旋转式摇床培养96h。每天定时取样测定各种发酵代谢参数，测定结果

4、为3个样的平均值。(4)氨基酸添加方式称取一定重量的Val、Leu和Ile在紫外灯下照射12h，并于发酵进行到36h时分别在不同的摇瓶中添加0.05g/100ml的Val、Ile、Leu。1.2试剂和仪器乙酸、丙酸、丙酮酸、丁酸和异戊酸均为分析纯；Val、Leu、Ile、牛血清白蛋白为生化试剂；色谱仪为AgilentHP1100(检测器：G1314A紫外可见波长检测器；进样器：G1328A)；酶标仪为ThermoMK3(ElectronCorporation)。1.3测定方法(1)生物量测量采用测量菌丝干重法(Drycelll发

5、酵液，过滤后用蒸馏水洗菌体，连同滤纸于80℃烘至恒重后称量。(2)总糖、还原糖测定采用斐林试剂法［9］。(3)铵离子浓度测量采用Berthelot比色法［10］。(4)以杯碟法［8］测生物效价，乙酰螺旋霉素为标准品，枯草芽孢杆菌作为鉴定菌。(5)产物组分以及胞外有机酸测定。HPLC法测定有机酸乙酸、丙酸、丙酮酸和α-酮戊二酸色谱柱：AquaSep(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(98.5∶1.5)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器

6、波长210nm，柱温30℃。丁酸和异戊酸色谱柱：Shim-packVP-ODS(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为0.01mol/L磷酸水溶液(用NaH2PO4调节pH至2.3±0.1)∶甲醇(60∶40)，流速1ml/min，进样量20μl，检测器波长210nm，柱温30℃。HPLC分析发酵样品取必特螺旋霉素发酵液于3000r/min离心10min，取上清液于-20℃冷冻保存备用。分析时取1ml上清液l0000r/min离心10min，上清液用0.45μm合成纤维素酯膜进行真空过滤后，取20μl进样。按照文献［11］对

7、发酵液中的有机酸定性，并对照有机酸标准曲线对有机酸进行定量。(6)丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶活力测定无细胞粗提液的制备4℃冷冻离心(4000r/min，5min)收集菌体，用10%(M/V)的蔗糖溶液清洗两次后，悬浮于5ml的含20%甘油的0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH7.4)中，用高压破碎仪(JG-1A)破碎，操作压力200Mpa。破碎液在4℃、12000r/min下离心30min，取上清液进行酶活测定。酶活测定丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶分别按照文献测定按文献［12，13］的方法进行，一个酶活单位定义为1min

8、内酶催化产物生成的微摩尔数，比活力用每毫克蛋白中所含酶活单位表示。采用酶标仪实时跟踪检测。蛋白质测定用考马斯亮蓝G-250法［10］，以牛血清白蛋白作标准曲线。2结果2.1Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素产量的影响在必特螺旋霉素发酵过程中添加Val、Ile与