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《rhoa-rho激酶信号通路在血管紧张素ⅱ刺激心肌成 纤维细胞增殖和胶原合成中的作用 》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、RhoA/Rho激酶信号通路在血管紧张素Ⅱ刺激心肌成纤维细胞增殖和胶原合成中的作用汪祥海，伍卫，杨军，方昶，耿登峰，黄至斌【摘要】 【目的】探讨RhoA/Rho激酶信号通路在血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）刺激心肌成纤维细胞（cardiacfibroblasts，CFBs）增殖和胶原合成中的作用。【方法】采用胰酶消化、差速贴壁法培养新生SD大鼠CFBs,并用AngⅡ诱导CFBs增殖和胶原合成。采用四氮唑盐比色法测定细胞增殖,羟脯氨酸法测定CFBs胶原含量,RT-PCR检测RhoA/Rho激酶mRNA的表达，BS-P
2、）表达作为Rho激酶功能活化的标志。【结果】AngⅡ(10-7mol/L)刺激48h可诱导新生SD大鼠CFBs的Rho激酶活化（Ｐ0.01），上调RhoA、Rho激酶mRNA表达(Ｐ0.05,Ｐ0.05)；Rho激酶特异性抑制剂Hydroxyfasudil(H4413)对AngⅡ刺激的CFBs增殖与胶原合成具有明显的抑制作用(Ｐ0.05,Ｐ0.05)。【结论】RhoA/Rho激酶信通路可能在调控AngⅡ刺激CFBs增殖和胶原合成中发挥重要作用。【关键词】心肌成纤维细胞；Rho激酶；血管紧张素ⅡAbstract：【Objective】T
3、oinvestigatetheroleofRhoA/Rho-kinasesignalpathethodoftrypsindigestionanddifferentialanchoringvelocity.StimulationoftheCFBsodel.ProliferationofCFBsetricassay.SynthesisofcollagenRNAinedusingsemi-quantitativeRT-PCRanalysis.Theextentofphosphorylationofmyosin-bindingsubunit(
4、MBS-P)ofmyosinphosphataseulationofneonatalSDratsCFBsol/L)significantlyactivatedRho-kinase(Ｐ0.01),andsignificantlyincreasedtheexpressionofRhoAandRho-kinasemRNA(Ｐ0.05,Ｐ0.05).PretreatmentofCFBsaybeoneofthemostimportantsignaltransducerforAngⅡ-inducedCFBsproliferationandcoll
5、agensynthesisinneonatalSDrats.Keya产品；小鼠抗大鼠波形蛋白单克隆抗体、血管平滑肌肌动蛋白单克隆抗体均购自武汉博士德生物试剂公司；山羊抗大鼠MBS-P单克隆抗体购自SantaCruz公司；总RNA提取试剂(Trizol)购自Gibco公司；逆转录试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司；羟脯氨酸试剂盒购自南京建成公司；SABC试剂盒购自博士德生物试剂公司。1.3CFBs的分离、培养取1～3d龄的SD大鼠,无菌开胸,剪取心室,用D-Hanks液清洗,剪碎,用1.25g/L胰酶消化液反复消化后(37℃恒温
6、摇床摇动8～10min),分别收集各次消化上清液,加等量100mL/L胎牛血清的DMEM培养基,离心,弃上清液,取沉淀加100mL/L胎牛血清的DMEM培养基,制成细胞悬液,接种培养瓶中,置37℃、5%CO2培养箱内培养。差速贴壁90min,去除心肌细胞。实验采用3～6代细胞。1.4 CFBs的鉴定1.4.1病理形态学观察 用倒置显微镜观察心肌成纤维细胞的形态学特征。1.4.2SABC法免疫组织化学染色滴加正常山羊血清封闭液,室温20min；滴加一抗工作液,37℃孵育60min；采用山羊血清和PBS作为一抗替代物作阴性对照；PBS洗3
7、次；滴加生物素化的山羊抗小鼠IgG,37℃孵育20min；PBS洗3次；滴加试剂SABC,37℃孵育20min；PBS洗4次；DAB显色,显微镜下控制显色时间,蒸馏水洗涤；苏木素复染。1.5 MTT法测定取对数生长期CFBs5×103个细胞接种于96孔板中,37℃、5%CO2及饱和湿度下培养24h后换无血清培养基,继续培养24h后,使细胞进入生长静止期，吸弃各孔培养基,继之分组再培养48h。实验分组(各组DMEM培养基中含100mL/L胎牛血清):含胎牛血清的DMEM培养基组；含AngⅡ10-7mol/L组；含AngⅡ10-7mol/
8、L及H441310-５mol/L组；含H441310-５mol/L组。在分组培养后的96孔板每孔中加入5g/LMTT10μL，置37℃4h后，弃上清，加入100μLDMSO震荡15min后，在酶联免疫检测仪上490nm处
