耐寒转基因木薯田间检测与木薯耐寒基因的克隆和功能分析

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1、耐寒转基因木薯田间检测与木薯耐寒基因的克隆和功能分析1前言1.1木薯的生物学特性木薯，拉丁学名为MaaPohl,英文名称为cassava，又称树薯、南洋薯、木番薯，是大戟科（Euphorbiaceae)木薯属、ManihotP.Mill.)植物，为多年生作物。木薯的须根系与其他种类植物相比略显稀疏，但其可深入土壤达2m，使木薯可以更好地利用土壤深层水分，更加耐旱耐贫瘠。木薯块根呈圆柱形、圆锥形或纺_形，最大可长达Im，直径10cm，其中所含干物质的80%?90%为淀粉，但块根中蛋白含量较少，每千克干物质中仅含蛋白5?15g(Yeohera

2、/.，1996)，所以人们在以木薯为主食时，还要注意从其他食物中获取人体必需的营养物质，维持体内代谢稳定。鲜薯块根采收后极易腐烂变质，因此，釆收后必须马上将其进行处理，可用来直接食用，制作淀粉，磨木薯粉、制作饲料等。另外，采前三周对木薯进行修剪可以增加块根中糖和淀粉含量，减缓鲜薯采后腐败变质的速度（vanOirschotera/.，2000)。莲直立、木质、高2?5ni，脆而易折，常用来扦插进行无性繁殖。莲的横切面可分为表皮、皮层、木质部、髓四部分。表皮层光滑具醋质；皮层厚而质软，呈绿色，含有叶绿素并具有乳管，含有白色乳汁；髓白色，无横膈

3、膜，海绵状、富含水分（El-Sharkam，宽约4?6mm(Alves，2002)、褐色、种皮硬壳质，胚乳肉质，子叶宽且扁。种子成熟后，一般自由散落在母体植株周围或由昆虫搬移至几米外，由此方式将种子传播开来（Eliase?fl/.,2000；Eliasetal.,2001)。刚刚收获的种子是休眠的，需要放置3?6个月才能发芽（Jenningsera/.，2002)，种子的活性可保持一年，但是一般在六个月时，其活性开始下降（RajendraneZa/.,2000)。在生产上，人们一般不使用种子繁殖，而是用莲段扦插进行无性繁殖。1.2木薯的起

4、源及分布木薯起源于南美洲亚马逊热带雨林地区，约在5,000年前由其野生祖先Manihote:sculentcissp.flabeUifoIici观养面来，开始被人类驯化（El-Sharkae，2002)。在亚洲的热带、亚热带地区，土壤肥力较好的低地主要用来种植水稻，因此，木薯被种植与肥力稍差的山坡上（Hoaetal.,2003；Bagumaetal.,2008)。木薯可在年降水量600mm的半干旱地区至年降水量6,000mm的半湿润、湿润地区种植（DeTafiirD?i8-Tvector从宝生物工程（大连）有限公司购买。2.1.2植物材料

5、华南8号pVKH-35S-C5FJ-pA和pCA-CP-C5F3-pA转基因木薯，由本实验室提供。华南木薯8号，由中国热带农业科学院品种资源研究所种质圃提供。拟南芥(Arabidopsisthaliana)哥伦比亚(Columbia)野生型种子，由本实验室保存。2.1.3酶与试剂盒TaqDNA聚合酶，限制性内切酶、BamHl，T4DNALigase：Fermentas公司。2000marker(DS?2000)、15000marker(DS?15000)广州东盛生物科技有限公司。DNA提取试剂盒：柱式植物DNAout试剂盒北京天恩泽基因科

6、技有限公司。质粒提取试剂盒：EZ-10柱式质粒小量抽提试剂盒生工生物工程（上海）有限公司。胶回收试剂盒：AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒爱思进生物技术（杭州）有限公司。TRIzol伴侶试剂盒：北京天恩泽基因科技有限公司。3结果与分析............37-643.1转基因木薯田间农艺性状观察............37-513.2木薯MeCBFl基因的克隆............51-543.3MeCBF1基因序列比对............54-563.3.1核苷酸序列分析............54-553.3.2氨基酸序列分

7、析............553.3.3MeCBF1基因的进化树分析............55-563.4植物表达载体pVKH-35-MeCBF1-pA的构建............56-603.5拟南芥转化及抗性试验............60-613.6MeCBF1基因的时空表达分析............61-643.6.1植物总RNA的提取............61-623.6.2荧光定量PCR............62-644讨论............64-684.1关于转基因株系的农艺性状............64-

8、654.2关于转基因株系的抗寒生理指标............65-664.3关于启动子的讨论............664.4关于木薯MeCBF1基因的探讨............66-68