丝氨酸蛋白酶抑制剂基因spink3对肝癌细胞株bel-7402作用地研究

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1、摘要丝氨酸蛋白酶抑$蜊KazalIII型(serineproteaseinhibitor，Kazaltype3，SPINK3)是一种胰蛋白酶抑制剂，在胰腺癌、大肠癌，乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤中高表达，但其对肝癌细胞株的作用研究尚未见报道。为此，本文构建了spmk3基因的表达载体(pEGFP．N1-spink3)，干涉载体(pGenesil．1．O-spink3(123)和pGenesil一1．0-spink3(143))和检验载体(pGenesil一1．O-spink3(123)-spmk3、spi

2、nk3(143)一spink3和一HK-spink3)。将各检验载体进行尾静脉液压转基因至小鼠肝脏，用荧光显微技术观察与SPINK3融合表达的增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP)的阳性细胞率，筛选出最佳干涉载体。采用脂质体介导法将4种质粒(表达载体pEGFP．N1．spink3及其对照pEGFP．N1，最佳干涉载体pGenesil．1．0一spink3(123)及其对照pGenesil一1．O-HK)转染肝癌细胞株BEL．7402，并用G418选择性

3、培养基筛选出稳定转染细胞株。对正常BEL．7402细胞株和上述筛选出来的四种稳定细胞株用下列方法进行检测：通过HE染色观察细胞形态结构；荧光显微镜下观察细胞形态以及EGFP分布；通过计数法和普通MTT法绘制细胞的生长曲线；通过PCNA细胞免疫化学检测细胞中PCNA的表达变化：通过Hoechst33258染色检测细胞凋亡；通过甲基纤维素半固体培养基检测集落形成率；通过药物MTT法检测细胞的耐药性。结果表明：SPINK3．EGFP融合蛋白均匀分布在细胞质中，细胞核无荧光，并且在细胞核外侧核膜周围表达量较高，为典

4、型的分泌性表达模式；spmk3能抑制肝癌细胞株BEL一7402增殖，但不引起细胞凋I二；sp／nk3能够降低肝癌细胞株BEL．7402恶性程度，但对其耐药性无明显影响。关键词：丝氨酸蛋白酶抑制剂KazalIII型，肝癌细胞株BEL．7402，细胞增殖，细胞凋亡ABSTRACTThesefineproteaseinhibitor，Kazaltype3(SPINK3)isatrypsininhibitorwhichishighlyexpressedinpancreaticcancer,colorectalcan

5、cer,breastcancer，prostatecancer,livercancerandothertuIIlors．buttheresearchontheeffectofspink3onhepaticcancercellstrainhasnotbeenreported．Therefore，theexpressionvector(pEGFP-N1-spink3)，interferencevectors(pGenesil．1．O印加昭(123)andpGenesil-1．O-spink3(143))andt

6、estvectors(pGenesil．1．O-spink3(123)-spink3，pGeneSil．1．0一spink3(143)-spink3andpGenesil一1．0-HK-spink3)wereestablished．Theconstructedtestvectorswereadministratedusingahydrodynamics-basedprocedureinthetailveinoflittlerattoselectthebestrecombinantinterferencepl

7、asmidusingfluorescencemicroscopytechniquetoobseⅣeenhancedgreenfluorescentprotein(EGFP)-positivecellrate．Next，theexpressionvectorpEGFP．N1-spink3anditscontrolpEGFP-N1，interferencevectorpGenesil-1．O-spink3(123)anditscontrolpGenesil．1．0．HKwerestablvtransfected

8、intohepaticcancercellstrainBEL-7402invitrobylipofectamineandtheirstablvtI．ansfectedcellstrainswereselectedbyG418．Then，thehepaticCanCercellstrainBEL．7402andthef．ourkindsof8tab⋯Yransfectedcellstrainsabovewerede