人丝氨酸蛋白酶抑制因子hespintor成熟肽的基因克隆研究

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1、人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆研究杨勇1林琳2(1大连市妇幼保健院检验科辽宁大连116033;2大连市友谊医院心内科辽宁大连116001)【摘要】目的：阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达载体贺定基础。方注：提取pMD19-TSimpleVecto卜Hespintor克隆质粒后，应用RT-PCR法扩增Hespintor成熟肽基因片段，对Hespintor成熟肽克隆载体进行构建，及双酶切反应鉴定。结果：琼脂糖凝胶电泳，在约2

2、30bp处可见1条特异性条带；蓝斑和白斑斑点数量比对大约为1:1,说明转化效率大约为50%左右；经BamH1和Hind111双酶切鉴定，约230bp处的条带为所克隆的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因片段。结论：重组克隆质粒pMD19-TSimpleVector-Hespintor成熟肽基因构建成功。【关键词】人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因克隆RT-PCR【中图分类号】R39【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2014)21-0078-02在肿瘤的生长、血管生成以及侵润和转移过程中，除了生长因子与抑癌基因突变、细胞周期改变等

3、尚有机制的参与外，蛋白酶扮演了最终共同途径的角色,并且在功能性或病理性组织重建过程中起到重要的作用［1］。蛋白酶的活性可由多个层次进行调控［1-3］,但最直接的方法还是阻断蛋白酶的活性。过表达的蛋白酶抑制因子或者人工合成的蛋白酶抑制因子都能有效地阻断蛋白酶活性，防止细胞外基质的降解［1,2,4］。因此，蛋白酶抑制因子的作用被更多的研究和关注，其中对组织金属蛋白酶抑制因子的研究最为深入，遗憾的是其临床应用效果并不理想［2］。丝氨酸蛋白酶抑制因子是一类丝氨酸蛋白酶活性调节因子，参与血凝、纤溶、炎症、免疫反应、胚胎发生和个体发育过程。根据它们的序列、二硫键数S和三维结构，至少可

4、以归类为18个非同源蛋白质家族。其中，Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子是较为保守的家族之一，目前已发现10多种，其成员主要包括PSTI、TATI、RECKA、ECRG2以及鸟类的卵清蛋白、顶体蛋白抑制因子、弹性蛋白抑制因子、溶血酶抑制因子等［5-7］。应用抑制性差减扣除杂交技术研究了HBVDNA聚合酶反式调节靶基因，从肝母细胞瘤细胞系HepG2中筛选得到一未知功能新基因，经RT-PCR验证后，结合生物信息学确定该新基因属于一种新Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制因子，命名为hespintor［8］＜，MJ源分析表明，hespintor具存与食管癌相关基因2高度同源的serpin

5、基本结构。由于ECRG2具奋抑制肿瘤细胞的增值、侵袭及转移等作用，因此提示hespintor可能也具有抑制肿瘤的侵袭与转移的能力，它在细胞中的生物学功能以及抗肿瘤作用有待于深入研究［9-11］。为了研宄hespintor对肿瘤细胞的增值、侵袭和转移的抑制作用，采用基因克隆技术建立hespintor的原核表达体系及纯化方法，观察hespintor重组表达蛋白在体内外是否对肿瘤细胞而行增值具有抑制作用。本文主要是阐明人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽的基因克隆过程，从而获得人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽克隆载体，为后续构建Hespintor原核表达

6、载体奠定基础。i.材料与方法1.1材料1.1.1菌株与质粒(1)人肠杆菌菌株E.coilDH5α感受态细胞由本人连人学医学院中心实验室提供。(2)pMD19-TSimpleVector购自宝生物工程(大连)有限公司。1.1.2引物设计与合成根据GenBank上公布的人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor基因序列，通过运DNAmanversion4.0软件设计引物扩增人丝氨酸蛋白酶抑制因子Hespintor成熟肽基因。引物Fl、F2自行设计交由宝生物工程(大连)冇限公司合成。FIS'-GGATCCGCCTAAGCCCCG-S*F25'-GCGCAAGCTTAT

7、CACATTTTCCATATTTTTC-3,1.1.3主要试剂1.1.4主要设备1.2方法1.2.1提取pMD19-TSimpleVector-Hespintor克隆质粒质粒提取试剂盒由TaKaRa公司提供，操作过程严格按照说明书进行，产物置于-40°C保存。1.2.2PCR扩增Hespintor成熟肽基因片段采用2×TaqPCRMasterMix，以pMD19-TSimpleVector-Hespintor克隆质粒为模板，F1/F2为引物，扩增Hespintor基因片段。1.2.3回收纯化Hespintor成熟肽