厄罗替尼对肺腺癌细胞凋亡的影响

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1、厄罗替尼对肺腺癌细胞凋亡的影响作者：白小燕牟晓燕姜淑娟王亚丽刘庆亮【摘要】目的研究厄罗替尼对人肺腺癌细胞株A549细胞凋亡的影响以及对表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达的影响。方法采用MTT法检测不同浓度的厄罗替尼对A549细胞的增殖抑制作用;以倒置相差显微镜、流式细胞术、TUNEL法及DAPI荧光染色法检测细胞凋亡;以免疫荧光法分析厄罗替尼对EGFR蛋白表达的影响。结果厄罗替尼抑制A549生长呈时间浓度依赖性;厄罗替尼处理A549后倒置相差显微镜、DAPI及TUNEL均见到明显的凋亡细胞(P<0.05);药物处理组使细胞发生明显的G1期阻滞(P<0.05);TU

2、NEL检测到200μmol/L厄罗替尼组细胞凋亡率为(42.13±1.4)%，显著高于对照组(0.82±0.03)%(P<0.05);免疫荧光法表明厄罗替尼明显下调EGFR表达(P<0.05)。结论厄罗替尼杀伤A549细胞的机制与介导细胞凋亡、阻滞细胞周期于G0/G1期及阻滞EGFR信号途径有关。【关键词】厄罗替尼;EGFR;A549细胞;细胞凋亡　　【Abstract】ObjectiveToexploretheeffectsofErlotinibonapoptosisandexpressionofEGFRinhumanpulmonaryadenocarcinoma

3、celllineA549cells.MethodsMTTassayineA549cellsproliferation.Invertedmicroscope,floetry,DAPIandTUNELinedbyimmunofluorescence.ResultsErlotinibinhibitedthegroedependent.Thecellstreatedorphology(P<0.05)andG1phasearrestting(P<0.05).Theapoptosisrateof200μmol/LErlotinibgroup〔(42.13±1.4)%〕muno

4、fluorescenceassayshoa公司,厄罗替尼(Erlotinib，商品名特罗凯)由罗氏公司惠赠。EGFR兔抗人多克隆一抗购自奥博森公司，FITC标记羊抗兔IgG及DAB试剂盒购自北京中杉公司，AnnexinV/PI细胞凋亡检测试剂盒、细胞周期试剂盒购自晶美公司。TUNEL试剂盒购自美国罗氏公司。LabsystemsMutisKanAscent全自动酶标测试仪购自芬兰Labsystems公司,EPICSXL4型流式细胞仪购自美国Beckmancoulter公司。IX51倒置式基础型显微镜Olmpus购自日本。　　1.2细胞培养和分组人肺癌A549细胞株培养于10%

5、FCS、100U/ml链霉素、100U/ml青霉素的PRMI1640培养基细胞贴壁80%时以0.25%胰酶消化、计数及传代，1ol/L，B组);中浓度组(厄罗替尼100μmol/L，C组);高浓度组(厄罗替尼200μmol/L，D组)　　1.3药物配制和使用厄罗替尼用适量DMSO溶解，储存在-20℃，药物活性无改变，每次实验前解冻，用新鲜培养液配成相应工作浓度。所有实验中的DMSO终浓度均小于0.1%，根据AugustineRauch等的研究成果〔4〕,该浓度的DMSO对实验结果无显著影响。　　1.4四甲基偶氮唑盐(MTT法)检测细胞增殖0.25%的胰蛋白酶消化对数期生长的细胞

6、，悬浮于含10%FCS的RPMI1640培养液中，调整细胞浓度为5×104细胞/ml，每孔100μl接种于96孔培养板，5000细胞/孔，培养24h后，去上清分别加入含有不同浓度厄罗替尼的RPMI1640培养液100μl，使厄罗替尼的终浓度为25、100、200μmol/L。同时设阴性对照组、空白对照组，阴性对照组为只加RPMI1640培养液，空白对照组为不加细胞而只加培养基，每组设3个平行复孔，分别培养24、48、72、96h后，每孔加入MTT20μl(5mg/ml)，混匀，37℃孵育4h后，吸去上清液，加入150μl的DMSO，振荡培养板10min，用酶标仪检测每孔490n

7、m波长吸光度值(OD)，实验重复3次求其平均值。据吸光度值计算细胞抑制率。抑制率(%)=(1-实验组平均值OD490/对照组平均值OD490)×100%，以药物浓度为横坐标,抑制率为纵坐标,绘制细胞生长抑制曲线。上述实验重复3次。　　1.5细胞凋亡形态学观察在倒置显微镜下观察培养瓶中细胞的生长状况及形态学改变并拍照。　　1.6流式细胞仪、DAPI荧光染色法及TUNEL染色法检测细胞凋亡　　1.6.1流式细胞仪细胞接种在小皿中，37℃孵育24h后按以上分组方法加药，48h后常规胰酶消化制成1×