反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经nogo

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1、反义寡核苷酸抑制大鼠损伤视神经Nogo作者：袁容娣　叶剑　彭锡嘉　刘少章【摘要】　　目的：观察反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-A的影响。方法：实验分为对照组、随机序列组、和2，5，10μmol/L3种Nogo-A反义寡核苷酸浓度组。大鼠视神经钳夹伤后，采用逆转录-聚合酶链反应法（RT-PCR），半定量分析反义寡核苷酸对损伤视神经Nogo-AmRNA表达量的变化。结果：反义寡核苷酸均显著降低Nogo-AmRNA的表达（P<0.01），随机序列对Nogo-AmRNA的表达无影响(P>0.05)。结论：反义寡核苷酸对视神经损伤后Nogo-AmRNA表达有抑制作用。【关键词】反义寡核

2、苷酸　Nogo-A　视神经　创伤　RT-PCR　　EffectsofantisenseoligodeoxynucleotidesonNogo-AmRNAexpressionininjuredopticnervesAbstractAIM:Toobservetheeffectsofantisenseoligodeoxynucleotides(ASODN)onNogo-AmRNAexpressionininjuredopticnerves.METHODS:Atotalof30ratssequencegroupandtestgroups(2μmol/L,5μmol/Land10μmol/LNogo

3、-Aantisenseoligodeoxynucleotides).reversetranscriptase-polymerasechainreaction(RT-PCR)methodRNAininjuredopticnerves.RESULTS:TheresultofRT-PCRshoRNA(P<0.01),randomsequenceantisenseoligodeoxynucleotideshadnonoticeableeffectonNogo-AmRNA.CONCLUSION:Nogo-Aantisenseoligodeoxynucleotidescaninhibitthee

4、xpressonofNogo-AmRNAininjuredopticnerves.·KEY-MLV逆转录酶说明书进行操作。取各实验组反转录产物2μL，按以下条件进行扩增：（1）95°C变性样品5min；（2）94°C变性30s；（3）50°C退火40s；（4）72°C延伸60s；（5）返回反应（2），进行29个循环。最后一个循环72°C延伸10min。PCR反应产物10μL加载样缓冲液1μL，以1×TAE为电泳缓冲液，在20g/L琼脂糖凝胶上电泳约1h(电压100V)。电泳完毕后，将琼脂糖凝胶经Lab,Marker3讨论视神经损伤是常见的一类眼外伤，预后不良，约有40%～50%的患者失明。

5、在颅脑损伤中，视神经损伤的发生率为0.3%～5.2%。传统的观点认为中枢神经受损后不能再生。然而，近年来许多研究证明在一定条件下，中枢神经可以再生。中枢神经系统髓磷脂是髓鞘的化学成分，是由成熟的少突胶质细胞的质膜生长形成的。1988年SchAbIN-1抗体能和NI-35/NI250结合并可以选择性地抑制成熟少突胶质细胞及中枢神经系统白质对轴突再生的抑制作用，促进轴突再生[7-9]。如将产生IN-1抗体的杂交瘤细胞注入大鼠背侧额皮质，然后切断动物的皮质脊髓束，发现损伤部位有大量再生的轴突芽，2～3m的轴突芽及轴突束，对照组虽然也有再生轴突芽，但其生长很少超过1mm[10]。2000年初，科学

6、家成功地克隆了抑制神经再生基因——Nogo。它编码抑制性蛋白NI-35/250。Nogo基因编码长度为3489bp，通过可变启动子和可变RNA剪接方式，转录的mRNA有3种。对应的蛋白分别称为Nogo-A，B和C。Nogo-A的全长序列对神经生长具有强烈的抑制作用。它是髓鞘源性的神经突生长抑制因子及单克隆抗体IN-1的抗原。IN-1抗体可以中和其抑制作用[7-9,11]Nogo基因的成功克隆，为从基因水平治疗视神经损伤提供了可能。Nogo-A对中枢神经再生具有强烈的抑制作用。Nogo基因的发现，为我们从基因水平研究视神经损伤修复提供了一个新途径。反义技术是根据核酸杂交原理设计针对特定靶序列

7、的反义核酸，从而抑制特定基因的表达，高度专一地阻断其靶基因的表达。反义寡核苷酸的优点在于：（1）反义寡核苷酸是遵照靶基因特异性设计合成，只有互补的碱基之间才能够结合。Saison等应用HARAS基因点突变区域的反义寡核苷酸能够选择性地抑制突变基因的表达，而正常基因不受影响。与其它抑制剂比较，这种方法特异性高。（2）反义寡核苷酸较容易合成。（3）导入途径适当，反义核酸有较高的局部反应。反义寡核苷酸可以与靶mRNA杂交，形成