成年sd大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定

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1、成年SD大鼠心肌细胞分离及其胞内钙离子动态变化测定【摘要】目的：建立稳定的成年SD大鼠心肌单细胞分离方法，并对心肌细胞内Ca2+动态变化进行测定。方法：用改进的Langendorff装置，行大鼠主动脉插管逆向灌流(温度、pH、水质恒定)，用混合液(0.6mg/mL胶原酶Ⅱ+0.06mg/mL蛋白酶+1mg/mL牛血清白蛋白)消化心脏，经3次不同浓度含钙台式液复钙后得到钙稳态心肌细胞；室温静置1～2h后于激光共聚焦显微镜下测定Ca2+的动态变化。结果：得到70%～90%长杆状活细胞，钙稳态心肌细胞可占40%～60%；fluo_4　AM负载染色后可记录到典型的诱发钙瞬变。结论:胶原酶和蛋白酶混

2、合液主动脉逆向灌流方法可以得到具有正常生理功能的钙稳态心肌细胞，可用于心肌细胞内钙信号研究。【关键词】大鼠心肌细胞细胞分离激光共聚焦显微镜　　CardiomyocyteIsolationfromAdultSDRatHeartforConfocalMicroscopicIntracellularCa2+Imaging　　［Abstract］Objective:TodevelopastablemethodforadultSDratsinglecardiomyocyteisolation，andthentodeterminetheintracellularCa2+signallingbyconf

3、ocalimaging.Methods:Ratheartixture［collagenaseⅡ(0.6mg/mL),pronase(0.06mg/mL)andbovineserumalbumin(1mg/mL)］usingamodifiedLangendorffsystem.Thetemperature,pHandesofre_calcificationhomeostasisventricularcardiomyocytes.SinglecellicroscopicCa2+imagingafterstorageatroomtemperaturefor1～2hours.Results:The

4、rehomeostasiscells.InsinglecalciumhomeostasiscardiomyocytescalciumtransientscouldbeevokedbyastimulatorandrecordedicroscopicsystemafterincubationethodtoprocuresinglecalciumhomeostasiscardiomyocytesfromadultSDratalphysiologicalfeatures,andfitforconfocalmicroscopicCa2+imaging.　　［Key负载方法检测分离所得心肌细胞内Ca2

5、+的动态变化，为心肌细胞内钙信号研究及其系列研究工作奠定基础。　　1材料与方法　　1.1动物与试剂　　实验动物：清洁级成年SD大鼠(广州南方医科大学实验动物中心提供)65只，雌雄不拘，体质量200～300g。主要试剂：胶原酶Ⅱ(277u/mg,Invitrogen公司，美国)，蛋白酶(5.8u/mg)、牛磺酸、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES(Sigma公司，美国)，fluo_4AM(MolecularProbes公司，美国)，其余试剂为国产AR试剂。　　1.2溶液组成及配制　　1.2.1台式液(mmol/L，用NaOH调节pH　7.35～7.45)NaCl136.9，KCl5.4，Ca

6、Cl21，MgCl2　1，NaH2PO4　1，HEPES　10，Taurine　10，D_glucose　11.1。　　1.2.2无钙台式液(mmol/L，用NaOH调节pH　7.35～7.45)NaCl136.9，KCl5.4，MgCl2　1，NaH2PO4　1，HEPES　10，Taurine　10，D_glucose　11.1。　　1.2.3酶液胶原酶Ⅱ液+蛋白酶液(酶液A)：取无钙台式液25mL加入胶原酶Ⅱ液15mg、蛋白酶液1.5mg混匀并用0.22μm滤器过滤。胶原酶Ⅱ液(酶液B)：取无钙台式液15mL加入胶原酶Ⅱ液9mg混匀并用0.22μm滤器过滤。　　1.2.4复钙液复钙液

7、A：取无钙台式液加入CaCl2至0.1mmol/L，BSA至1mg/mL。复钙液B：取无钙台式液加入CaCl2至0.5mmol/L。BSA至1mg/mL。复钙液C：取台式液加入BSA至1mg/mL。　　1.3细胞分离　　腹腔注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉后，无菌状态下迅速开胸摘心，并置于4℃左右无钙台式液中清洗血污，剪除多余脂肪组织及修剪主动脉长度，立即行主动脉插管(深度不可超过主动脉瓣)，将心脏挂于Langend