人补体受体1型功能域scr1-3基因克隆表达及对急性脑缺血再灌注损伤保护作用

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1、第三军医大学硕士学位论文人补体受体1型功能域SCRl—3基因的克隆表达及对急性脑缺血再灌注损伤的保护作用术摘要缺血性脑血管病及脑再灌注炎症损伤已成为目前严重威胁人类健康和生命的主要疾病之一。其发病原理比较复杂，研究表明：补体系统被过度激活而产生的炎症效应片段是导致脑缺血再灌注(cerebralischemiaandreperfusion，CI／R)炎症损伤的主要始动因子之一。在经典、甘露糖结合凝集素(mannan—bindinglectin，MBL)、旁路三条补体活化途径中，虽然它们激活的起始位点各不相同，但

2、都在C3处汇合，形成C3／C5转化酶。如能结合C4b、C3b及抑制C3／C5转化酶的活性，则可阻断过量C3a、C4a、C5a、C5b一9等炎症效应片段的生成，即能在始动环节防止脑缺血再灌注炎症损伤的发生和发展。人补体受体1型(complementreceptortype1，CRl)SCRl．3功能域具有结合C4b的能力，能够抑制C3／C5转化酶的活性，阻断过量C3a，C5a及C5b．9的形成，在早期阶段防止补体系统的过度活化，预防CI／R损伤的发生与发展。本研究中从人外周血提取总RNA，RT-PCR扩增获得编

3、码CRl．SCRl．3的目的基因片段，构建pPIC9k—CRl．SCRl．3重组表达质粒，进行核苷酸序列鉴定，在毕赤酵母KM71中诱导分泌表达CRl一SCRl—3蛋白，SDS．PAGE及Western—Blot鉴定目的蛋白，用镍柱亲和层析纯化表达产物，观察目的蛋白CRl．SCRl．3在体外抑制补体的溶血活性以及对大鼠急性脑缺血再灌注损伤的保护作用。该研究获得以下主要结果：1．以人外周血提取的总RNA为模板，根据人CRl一SCRl—3的DNA序列设计一对引物，上游引物包含SnaBI酶切位点，可将目的基因连接到p

4、PIC9k载体的信号肽序列之后，下游引物含有6xHistag，终止密码子以及NotI位点，经RT-PCR扩增成功获得了617bp编码CRl一SCRl—3的目的基因片段；2．经SnaBI和NotI双酶切的目的基因片段CRl．SCRl．3及pPIC9k载体，在T4连接酶的作用下，构建重组表达质粒pPIC9k—CRl．SCRl．3，化学转化法转化DH5a，经菌落PCR初筛、SnaBI和NotI双酶切鉴定及华大基因测序鉴定，结果与GenBank中的相应序列同源性为100％，命名为pPIC9k—CRl一SCRl—3；4

5、本课题获得以下基金资助：(1)国家自然科学基金(30471723)(2)重庆市自然科学基金(2007BB5011)7第三军医大学硕士学位论文3．将SalI酶线性化的重组质粒pPIC9k—CRl一SCRl．3，电转化毕赤酵母KM71感受态细胞，MD平板初筛，再经不同浓度的G418平板复筛，菌落PCR鉴定，最终获得了9个高拷贝的阳性克隆子，并命名为pPIC9K—CRl一SCRl—3／KM71：4．挑取阳性重组子，在摇瓶水平发酵并用1％无水甲醇诱导表达，表达产物经SDS—PAGE及Western—Blot鉴定，结果

6、证实CRl一SCRl—3目的蛋白在毕赤酵母中成功分泌表达；5．表达蛋白经镍柱亲和层析纯化后，SDS．PAGE显示目标蛋白纯度较高，用BCA试剂盒测定纯化前及纯化后蛋白浓度，计算目的蛋白所得产率约为35％；6．体外CH50法检测CRl．SCRl．3的生物活性，结果显示：随着蛋白浓度的增加，CRl一SCRl．3的抑制补体活性不断增强，当浓度达到50肛g／ml时，CRl一SCRl—3蛋白即具有50％的抑制补体活性，表明CRl．SCRl．3蛋白在体外有良好的抑制补体活性功能；7．成功制备大鼠急性大脑中动脉栓塞(mid

7、dlecerebralarteryocclusion，MCAO)模型，结果显示：保护组神经功能评分及脑梗死体积明显低于CI／R手术组，生化指标方面：保护组MPO活性及MDA含量亦显著低于CI／R手术组，而SOD活性则明显升高。Western．Blot检测结果显示：保护组大鼠缺血侧大脑皮层C4b表达量明显下调：免疫组化结果显示保护组大鼠缺血侧大脑皮层C4b沉积明显减少；病理检测结果发现：假手术组未见明显病理改变，CI／R手术组梗死区血管周围有中性粒细胞侵润，大脑实质水肿，组织疏松、间隙增大，神经元核固缩，胞体缩

8、小变形，出现染色质凝集，胶质细胞增生；而保护组上述病理改变明显减轻，表明CRl一SCRl．3可减轻补体介导的脑缺血再灌注炎症损伤，对急性CI／R损伤起保护作用。综上所述，本实验成功构建了重组酵母表达质粒pPIC9k—CRl一SCRl—3，一分子量约27kD的CRl一SCRl—3目的蛋白在毕赤酵母中分泌表达，镍柱亲和层析纯化一步法可获得纯度较高的目的蛋白，体内外生物活性功能鉴定结果表明：该蛋白具有结合