人cr1功能域scr15-18在毕赤酵母中表达及其对肠缺血再灌注损伤保护作用

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1、第三军医大学硕士学位论文人CRl功能域SCRl5．18在毕赤酵母中的表达及其对肠缺血再灌注损伤的保护作用摘要肠缺血再灌注损伤(ische面ar印er凡sionilljuⅨLR)是外科常见的组织器官损伤之一，在严重感染、创伤、休克、心肺功能不全等疾患的病理演变过程中起重要作用，死亡率高。肠I／R损伤是多种因素作用的结果，其发病机制极其复杂。近年来的研究表明，补体系统过度活化在肠I／R损伤的发生与展中起着十分重要的作用，抑制补体活化已成为防治肠缺血再灌注损伤的重要策略。在缺血再灌注损伤等补体过度活化的疾病中，坏死的组织细胞

2、、MBL复合物、暴露的抗原和线粒体等通过经典、旁路和MBL三个补体途径共同激活补体。同时，补体活化产物C3a、C5a和C5b．9均参与了组织损伤过程，出现恶性循环。因此，单一的从某一条途径或某一活化产物阻断补体介导的损伤是不够的。在三条补体激活途径中，虽然活化起始点不同，但都在C3处汇合，通过C3转化酶裂解C3，继而形成C5转化酶，裂解C5，活化补体形成攻膜复合物(m铋lbr趾ea仕ackc伽叩1eX，MAC)，因此C3／C5转化酶是理想的抑制靶点。补体受体1型(c0玎叩lementreceptortype1，CRl)

3、是由30个短同源重复序列(shortconseIlsusrcpeats，SCR)构成的补体抑制因子，是体内唯一的既对经典、旁路、MBL三个补体激活途径的C3／C5转化酶有加速衰变作用，又有辅助I因子裂解C3b／C4b作用的补体调节蛋白。其中SCRl5．18，能结合C3b／C4b，阻碍C3／C5转化酶的形成，辅助I因子裂解C3b，C4b，进而抑制C3伦5转化酶，阻断和抑制C5a及C5b．9等炎症介质的产生，具有抗补体治疗的潜在应用价值。本研究在我室前期工作的基础上构建CRl．SCRl5．18的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母

4、中诱导分泌表达目的蛋白CRl．SCRl5—18，用Ni2+-NTA树脂亲和层析纯化表达产物，并观察目的蛋白CRl．SCRl5．18在体外抑制补体溶血的活性以及在体内对急性肠I瓜损伤的保护作用。研究取得了以下主要结果：1．根据人CRl．SCRl5．18DNA序列和pPIC9的多克隆酶切位点分别设计一对引物，本课题获得以下基金资助：(1)国家自然科学基金(30471723)(2)重庆市自然科学基金(2007BB5011)6第三军医大学硕士学位论文在上游引物(P1)通过励D，I酶切位点把目的片段连在信号肽序列的后面，下游引物

5、(P2)加入TAG终止密码、6XHIS标签和^协I酶切位点。以pET32a-sCRl—SCRl5．18重组质粒为模板，成功扩增了CRl．SCRl5．18Ⅸ临片段，片段大小为756bp。2．将PCR扩增获得的目的基因片段和pPIC9质粒经肠D，I十ⅣDfI双酶切，胶回收后，两者按一定比例用T4连接酶连接，构建重组质粒。重组质粒经酶切、PCR和测序鉴定正确，命名为pPIC9．CRl．SCRl5．18。3．勋，I线性化pPIC9．CRl．SCRl5．18，胶回收后电转化毕赤酵母GSll5感受态细胞，经组氨酸营养缺陷型培养基(

6、m平板)筛选重组酵母菌。经PCR鉴定确认，成功筛选到4个阳性酵母转化子，命名为pPIC9．CRl．SCRl5．18／GSll5。4．阳性转化子菌落接种BMGY增菌，换BMMY后在摇瓶水平经甲醇诱导表达，表达产物经SDS．PAGE和weSt锄blot证实，目的基因在毕赤酵母中成功分泌表达。5．CRl．SCRl5．18蛋白经Ni2+．NrA柱纯化后，基本无杂蛋白存在，表明采用亲和层析可实现CRl．SCRl5．18蛋白的一步快速纯化。纯化干燥后称重，蛋白最终得率为31．8m∥L，为高密度发酵奠定了基础。6．体外生物活性分析显

7、示，目的蛋白具有抑制补体溶血的活性，随着蛋白浓度的降低，抑制补体溶血的能力随之减弱，目的蛋白抑制补体溶血的活性有量效关系。表明我们制备的重组蛋白在体外有抑制补体活性的功能。．7．成功建立大鼠急性肠I瓜动物模型。体内实验发现：豫组的结果与假手术组的相比，血管通透性增加，ⅧO活性和MDA含量显著升高，而SOD活性降低，肠组织原位有大量的补体C3组分沉积，病理损伤严重，肠黏膜顶端上皮大片坏死，脱落，大量炎症细胞侵润、黏膜固有层水肿、瘀血、细胞构成增多；与I瓜组相比，CRl保护组肠血管通透性显著降低，MPO活性和MDA含量显著

8、降低，而SOD活性升高，肠粘膜组织原位仅有少量补体C3组分的沉积，病理损伤显著减轻。综上所述：本实验成功构建了CRl—SCRl5—18的毕赤酵母表达质粒，在毕赤酵母中分泌表达了CRl．SCRl5．18蛋白，并证实纯化后的CRl．SCRl5．18蛋白在体外有抑制补体活性的功能，在体内对大鼠急性肠I瓜损伤有抗炎保护作用。为进一步研究补