未培养微生物预苯酸脱氢酶基因克隆、表达和功能鉴定

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1、未培养微生物预苯酸脱氢酶基因的克隆、表达和功能鉴定摘要预苯酸脱氢酶(EC1．3．1．12)以NAD(P)十为辅酶催化预苯酸氧化脱羧生成对羟基苯丙酮酸，在L．酪氨酸的生物合成代谢中起关键作用。目前国际上有关预苯酸脱氢酶的研究主要集中在对来自于Aquifexaeolicus、Streptococcusmutans和Haemophilusinfluenzae等细菌的预苯酸脱氢酶的功能和结构研究，鲜见有关来自于环境未培养微生物的新型预苯酸脱氢酶的研究。本研究采用基于序列特异性直接测序的策略，筛选本课题组前期构建的碱性污染土壤样品

2、宏基因组文库AL01，发现阳性克隆pGXALl0028所携带的外源DNA片段中可能包含一个编码预苯酸脱氢酶的新基因，将其命名为pdhE。生物信息学分析结果表明：基因pdhE由609个碱基对组成，编码具有一个具有203个氨基酸残基的多肽；其相对分子质量约为22．3kDa，理论等电点为5．31。在DNA水平上，pdhE与一个来自于Novosphingobiumsp．PPlY的全基因组测序注释为预苯酸脱氢酶编码基因(GenBank登录号：FR856862．1)的一致性最高，为82％；在氨基酸水平上，PdhE与一个来自于Zymo

3、monasmobilis的预苯酸脱氢酶(GenBank登录号：Q04983．2)的相似性最高，相似性为65％，一致性为42％。采用pETBlueTM系统构建了包含肋E基因的重组表达克隆，采用镍柱亲和层析技术纯化得到了重组蛋白PdhE。基因的功能鉴定实验结果发现重组蛋白PdhE没有预苯酸脱氢酶的催化活性。结合简单组件结构分析结果，初步推测预苯酸脱氢酶的氨基末端的Rossmannp一0【．pfold结构是预苯酸脱氢酶的体现催化活性时的必需关键组件，其作用可能是帮助辅酶在活性中心定位。基于序列多重序列分析比较结果，采用融合PC

4、R技术，将大肠杆菌K．12菌株中编码预苯酸脱氢酶的“Rossmannp一仅一pfold”保守结构的DNA与pdhE融合，得到一个新的融合基因，将其命名为p锄BJ。采用pETBluelM表达系统表J,太__pdhE-1，并使用镍柱亲和层析技术分离纯化得到了重组蛋白P(mE一1。基因的功能鉴定实验结果表明重组蛋白PdllE一1恢复了预苯酸脱氢酶活性。生化性质分析实验结果表明，以预苯酸为底物，重组蛋白PdhE一1的最适反应温度为45℃，最适反应pH为8．O；重组蛋白PdhE一1的比活力为7．63U／mg。动力学参数分析结果表明

5、，重组蛋白PdhE．1的表观米氏常数‰为O．87mmol／L，催化常数‰at为10．08S～，对辅酶NAD+的％为O．13mmol／L。还发现代谢终产物L．酪氨酸(10mmol／L)对目标蛋白没有抑制作用。本研究有关编码预苯酸脱氢酶的新基因的功能鉴定结果为L一酪氨酸生产菌株的改良中具有重要的技术参考价值；在进一步利用其生化特性作为可能的新药研发的靶酶研究中具有重要参考作用。关键词：预苯酸脱氢酶L．酪氨酸未培养微生物宏基因组文库镍柱亲和层析技术GENECLONING,EXPRESSIONANDCHARACTERIZATIO

6、NoFAPREPHENATEDEHYDRoGENASEFRoMUNCUl月UREDSoILMICROORGANISMSABSTRACTPrephenatedehydrogenase(EC1．3．1．12)catalyzestheoxidativedecarboxylationofprephenateto4-hydroxyphenylpyruvateinthepresenceofNAD(P)十，whichplaysakeyroleintheL-tyrosinebiosynthesismetabolism．Currently

7、,moreandmoreresearchfocusonthefunctionandstructureoftheknownprephenatedehydrogenasefromAquifexaeolicus、Streptococcusmutans，andHaemophilusinfluenzae．It’Sinterestingtominingfornovelprephenatedehydrogenasefromunculturedmicroorganisms．Inthisstudy，thedirectsequencings

8、trategywasusedforscreeningametagenomiclibraryAL01fromalkalinesoilsamples，theclonepGXAL10028maycontainanovelgeneencodingprephenatedehydrogenase，whichwasnamedpdh