血管窦内皮细胞改变在肝癌组织缺血再灌注损伤中的作

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1、血管窦内皮细胞改变在肝癌组织缺血再灌注损伤中的作【摘要】目的研究肝癌组织缺血再灌注后血管窦内皮细胞（Sinusoidalendothelialcells，SEC）的损伤。方法兔肝脏注射VX2肿瘤组织混悬液，建立肝脏肿瘤和缺血再灌注模型。测定再灌注各时点组织中超氧化物歧化酶（SOD）和一氧化氮（NO）的含量；用HE和荧光脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法（TUNEL）染色观察和比较两种组织中SEC的凋亡情况。结果缺血再灌注后癌组织中的SOD浓度下降显著,于再灌注1h即达最低水平(64.5

2、9±4.97)，其后逐渐恢复但至再灌注7d仍低于再灌注前(121.12±6.88)。NO浓度在肝癌组织和正常肝组织均有下降。肝癌组织缺血再灌注后SEC凋亡细胞数量明显增加，至1d时达最高水平54(3.2)。至再灌注7d时阳性细胞仍多于缺血再灌注前33(4.9)，其凋亡细胞数量多于正常肝组织。结论SEC的改变在肝癌组织缺血再灌注后的损伤过程中起重要作用。肝癌组织的改变较正常肝组织更为显著。【关键词】肝肿瘤再灌注损伤凋亡兔0引言研究发现,肝脏及肝脏肿瘤缺血再灌注后可造成明显的损伤,其主要原因是氧自由基的

3、产生增加和细胞凋亡［1,2］。研究证明，肝脏肿瘤的生长必须依赖于血管的生成。肝脏肿瘤的消长和自身血管的增殖与凋亡有密切关系［3］。在相关研究中发现,除氧自由基对肝癌细胞的直接损伤外，缺血再灌注对与肝癌组织生长密切相关的微血管是否造成损伤及对肝癌细胞损伤过程中的作用还不清楚。我们在建立肝脏肿瘤组织缺血再灌注模型的基础上，对肝脏肿瘤组织内氧自由基的改变和血管内皮细胞的凋亡进行了观察，为研究肝脏肿瘤组织缺血再灌注损伤的机制和建立肝癌治疗方法打下基础。1材料和方法1.1材料纯种成年新西兰大白兔36只，雌雄不

4、拘，体重2.0～2.5kg，由第四军医大学实验动物中心提供。1.2模型制备及动物分组动物分为缺血再灌注前（对照组即假手术组）、缺血再灌注后0min、1h、1d、3d和7d共6个组,每组6只。取VX2瘤株组织块混悬液，超声引导下穿刺肝左中叶，缓慢推注0.5ml制作肝癌动物模型。动物以速眠新肌肉内注射麻醉（0.15ml/kg），开腹后找出接种肿瘤组织的肝左叶，分离供应有癌组织的肝左叶肝动脉分支，用无损伤血管钳阻断动脉血流60min后，松开血管钳恢复动脉血流。按各时间点切取肿瘤组织和正常肝脏组织，部分置－

5、70°C冰箱快速冷冻，部分置固定液固定以备SOD和NO检测和石蜡切片。SOD和NO试剂盒购自南京建成生物工程研究所。采用721－A型分光光度计。细胞凋亡测试盒购自美国罗氏公司(RocheDiagnosticsGmbH)。1.3检测项目及方法1.3.1SOD测试按试剂盒要求，设空白管（不加样本）、测定管(含待测组织匀浆、2.0ml75mmol/LNaHCO3/Na2CO3缓冲液、0.2ml0.3%TritonX100、0.1ml0.98mmol/LNBT、0.5ml15mmol/L盐酸羟胺和0.1m

6、l蒸馏水)及标准管（不加样本，加0.2ml蒸馏水，其余同测定管）。各管振荡混匀，37℃水浴15min；然后在样品管和标准管内加入1ml甲酸终止反应，充分混匀590nm比色，测SOD值。空白调零，按公式计算组织匀浆中SOD活力：亚硝酸盐单位（NU）／毫克蛋白数（mgprot）＝［2×（样品管吸光度－标准管吸光度）／标准管吸光度］×反应液总体积／(取样量（ml）×组织中蛋白含量)。1.3.2NO和NOS含量检测按试剂盒说明书要求制备组织匀浆并测定蛋白含量。同样按照NO说明书要求设定测定管、空白管及标准管

7、，加入相应试剂和待测标本，测定OD值按公式计算NO的含量。1.3.3HE染色组织块脱水后石蜡包埋，5μm连续切片,HE染色,光镜下观察。长条状细胞核内染色质致密浓缩，核碎裂及细胞质淡红色等为凋亡细胞。连续观察5个切片，计算凋亡细胞的百分率。1.3.4TUNEL染色按照细胞凋亡测试盒的操作流程进行：组织切片二甲苯中脱蜡、经梯度酒精水化、PBS缓冲液振洗后，以蛋白酶K温育30min（37℃），再用PBS振洗3次后，每次5min。切片滴加50μlTUNEL反应液，置湿盒内37℃孵育60min。PBS振洗3

8、次共15min，伊文蓝衬染后，加蛋白甘油液封片，荧光显微镜下观察，照相。胞核内出现黄绿色荧光为阳性细胞。取每个高倍镜视野（×200）计数凋亡细胞。除不滴加TUNEL反应液外，用同样方法和步骤反应进行阴性对照。组织切片标本上滴加DNA酶以裂解DNA，然后按照TUNEL标记步骤依次进行阳性对照。1.4统计学处理SOD和NO实验数据以±s表示,凋亡数据以中位数（M）与四分位间距（Q）表示，采用SPSS10.0软件进行统计分析，所用统计方法分别为完全随机分组设计的单变量的多组