过量胸苷对细胞周期素表达的影响

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1、过量胸苷对细胞周期素表达的影响：沈青，杨存明，张国成，姚裕家，付雪梅【关键词】细胞周期蛋白类　　【Abstract】AIM：ToexploretheeffectsofexcessivethymidineontheexpressionofcyclinA,B,D1ineachphasesofcellcyclebystudyingtherelationshipbetechanismofcellcycletransition.METHODS：Neonatalpigsrenaltubularepithelialcellsidineblocktechni

2、queandthedistributionofG1,S,G2phasesinedbyfloetry.TheexpressionofcyclinA,B,D1munocytochemistry.RESULTS：Floetryanalysisrevealedthat(99.5±0.8)%oftheneonatalrenaltubularepithelialcellsethodoftheexcessivethymidineblocktechnique.TheexpressionofcyclinAatG2phasesidinemaybeassociat

3、edidine；cyclins;kidneyTubules;epithelialcells　　【摘要】目的:探讨过量胸苷干扰细胞周期素细胞周期时相表达的特点，为进一步研究细胞周期转化以及细胞周期素与DNA合成的关系奠定基础.方法:应用二次过量胸苷阻断法进行新生猪肾小管上皮细胞体外同步化培养，采用流式细胞术进行鉴定；然后分别进行G1/S，S及G2期细胞CyclinA，B，D1mAb免疫细胞化学染色并进行图像分析.结果:二次过量胸苷阻断法可获取G1/S界面细胞为(995±08)%，S期细胞为(905±07)%，G2期细胞为(935±22)%，G2

4、/G1=220.G1/S，S，G2细胞CyclinA表达特点为G2期大于G1/S和S期（目标灰度值：1363±27，1450±14，1475±18，P<001）,CyclinB表达特点为G1/S期小于S和G2期（目标灰度值：1556±16，1488±22，1366±26，P<001），CyclinD1的表达特点为G2期大于G1/S期(目标灰度值：132.6±1.9，146.7±1.3，P<0.01)，S期小于G1/S期（目标灰度值：1588±11，1467±13，P<005）.结论:二次过量胸苷阻断细胞DNA合成可能与

5、细胞周期素表达的改变相关.　　【关键词】胸苷；细胞周期蛋白类；肾小管；上皮细胞　　0引言　　两次过量胸苷阻断法是首先被人们证实较为可靠的细胞体外同步化方法而被广泛应用［１］.脱氧胸腺核苷合成增加导致DNA合成的抑制是其细胞同步化的经典学说.然而，随着细胞周期调控机制研究的深入，细胞周期素在细胞转化过程中具有关键性的作用.为此，探讨细胞周期素在二次过量胸苷同步化细胞中的表达特点，为进一步研究细胞周期素与DNA合成的关系奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1细胞及主要试剂传4~5代新生猪肾小管上皮细胞［２］.胸苷（Sigma产品，

6、终浓度为2mmol・L-1）；低糖DMEM，1250胰蛋白酶（Gibco产品）；cyclinD＼A＼BmAb，生物素化二抗，SABC，DAB显色试剂盒(博士德生物工程公司产品)；胎牛血清（天津生物制品研究所）；CYCLETESTTMPLUSDNA试剂盒（BD公司产品）.　　1.1.2主要仪器设备万级层流工作室、BCM100型生物洁净工作台、ias2000图像分析系统（四川大学图像研究所研制）.　　12方法　　1.2.1肾小管上皮细胞同步化培养［３］正常培养细胞3~4d，达到大约50%-70%的覆盖率；加入胸苷（thymidine

7、），使其终浓度为2mmol・L-1，继续培养16~18h，使细胞停留在G1/S期边界；吸去培养液，洗1～2次，用新鲜的培养液培养12h；加入终浓度为2mmol・L-1的胸苷，继续培养20h；吸去培养液，洗1～2次，收集G1/S期细胞；在诱导的G1/S期细胞中，加入新的培养液，继续培养3h，收集S期细胞；在诱导的G1/S期细胞中，加入新的培养液，继续培养8h，收集G2期细胞.并配制1×106・mL-1细胞悬液备用.　　1.2.2流式细胞术DNA检测［４］DNA含量用ModFit2.0和DI2.8软件分析

8、.　　1.2.3常规免疫细胞化学［５］结果在Mias2000图像分析系统分析.　　统计学处理：平均目标灰度值以x±s表示，应用国际通用SPSS（Vol.10.0）进