皂角皂苷对smmc7721细胞caspase3表达的影响

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1、皂角皂苷对SMMC7721细胞Caspase3表达的影响【关键词】SMMC7721细胞;凋亡;Caspase3;皂角皂苷细胞凋亡的机制中，凋亡的细胞因子受体信号转导途径一直被人们所关注，尤其是细胞内蛋白水解酶(cysteinylaspartatespecificproteases，Caspase)〔1〕。Caspase是目前公认的细胞凋亡后期的共同途径。本实验以SMMC7721细胞株为研究对象，利用特殊工艺从皂角皂苷中提取有效部位，通过检测细胞的生存率及Caspase3的表达，探讨皂角皂苷对SMMC77

2、21细胞的诱导凋亡作用。　　1材料与方法　　1.1材料SMMC7721细胞株细胞由吉林大学第一医院提供。阿霉素、DAB购于Sigma，皂角皂苷由长春中医学院赠予，IMDM培养基和新生牛血清购于Hyclone，Trizol试剂购于Invitrogen，Caspase3引物和PCR试剂购于Takara。　　1.2SMMC7721细胞培养SMMC7721细胞置于完全培养基(10%Hyclone新生牛血清，IMDM培养液pH7.4)中，37℃，5%CO2培养箱中培养。细胞在无阿霉素的条件下培养1l。　　1.3亚甲基四唑

3、蓝(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)测定细胞生存率取对数生长期的SMMC7721细胞。消化、离心，使成单细胞悬液，计数，以细胞数1.0×104/孔接种于96孔板中。24h后，加入不同浓度的药物，单独应用阿霉素5μg/ml及阿霉素5μg/ml分别与皂角皂苷50、100μg/ml联合应用。24h后，每孔加入0.5mg/ml的MTT液20μl，4h后弃掉培养液，每孔加150μlDMSO，570nm测其吸光度值。实验重复5次。　　1.4SMMC7721细胞Caspase3mRNA的表达同剂量

4、药物作用24h，SMMC7721细胞中总RNA提取参照UltraspecTMIIRNAIsolationSystem(BiotecxLaboratories，INC)说明书进行，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，进行PCR反应。GAPDH引物序列为正义:5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，反义:5′AAGAATGGGTGTTGCTGTTGAAGTC3′，片段大小700bp。Caspase3引物序列为正义:5′TTTGTTTGTGTGCTTCTGAGCC3′,反义:5′ATT

5、CTGTTGCCACCTTTCGG3′，片段大小400bp。PCR反应条件：变性94℃，30s，退火59℃，30s，延伸72℃，45s。Caspase3为28个循环，GAPDH为25个循环。取PCR产物进行电泳，凝胶成像系统下观察并拍照。实验重复3次。　　1.5统计学处理数据均以x±s表示，用SPSS11.0软件进行多组间ANOVA分析。　　2结果　　2.1阿霉素和皂角皂苷对SMMC7721细胞生存率的影响阿霉素(5μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率(80%)与对照组(90%)比较无明显变

6、化。皂角皂苷(50、100μg/ml)单独作用于SMMC7721细胞时，细胞存活率也无明显变化。当阿霉素和皂角皂苷联合作用于SMMC7721细胞时，阿霉素5μg/ml+皂角皂苷50μg/ml组(52%)、阿霉素5μg/ml+皂角皂苷100μg/ml组(42%)与对照组或阿霉素组比较，细胞存活率明显下降(P<0.01)。　　2.2阿霉素和不同浓度皂角皂苷作用SMMC7721细胞Caspase3mRNA表达RTPCR结果表明：阿霉素单独作用SMMC7721细胞时，与对照组相比Caspase3mRNA表达

7、未见明显差异;阿霉素和不同浓度皂角皂苷共同作用时，与对照组和阿霉素单独作用时相比Caspase3mRNA表达明显增高(图1)。　　1.对照组;2.阿霉素5μg/ml;3.阿霉素5μg/ml+皂角皂苷50μg/ml;4.阿霉素5μg/ml+皂角皂苷100μg/ml　　图1阿霉素和不同浓度皂角皂苷作用下　　SMMC7721细胞Bcl2mRNA表达　　Caspase3处于细胞凋亡的下游，细胞凋亡有细胞外和细胞内两条经典的途径。在细胞外途径中，死亡信号的传导靠死亡配体与受体的结合来展开，接着死亡受体的死亡结构域与信号传

8、导分子结合，信号传导分子又与Caspase8酶原相连接，激活Caspase8使线粒体释放细胞色素C，或直接作用于Caspase3及其他下游的Caspase。在细胞内途径中，细胞内的死亡信号，例如DNA损伤、毒素和ATP耗竭等均可诱发线粒体释放细胞色素C，激活Caspase3降解底物使细胞凋亡〔3～6〕。　　实验结果显示：阿