松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响

《松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因表达的影响【摘要】［目的］研究松花粉对衰老细胞(2BS)内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21ethod］The2BScells28populationdoubling(PD)anddividedequallyintotheyoungcontrolgroup,oldcontrolgroup,middledosepinepollengroup(120mg/dl)andhighdosepinepollengroup(240mg/dl)ran

2、domly.Regulatethephasesofcellcyclebyfloetry，andthentheexpressionofp16INK4a，p21EM培养基中，37℃,5%CO2，饱和湿度培养箱中生长。细胞寿限为60～70代。至30代时随机取8瓶作为年轻对照组，至56代时随机取24瓶分成衰老模型组、松花粉中剂量组、松花粉高剂量组3组每组8瓶，分别以单纯完全培养基、120mg/dl含花粉血清培养基、240mg/dl的含花粉血清培养基培养8天［3］，收集细胞。配制松花粉血清液，使其终浓度分别

3、为120mg/dl与240mg/dl。　　1.1.2仪器与试剂FACScan流式细胞仪(Beckmancoulter);PCR仪（ABI9700）；凝胶成像仪（BioRad）。类标准胎牛血清（FBS）购自民海生物，MEM培养基（含非必需氨基酸、谷胺酰胺）为invitrogen产品。流式细胞周期检测试剂盒（上海杰美）；cDNA试剂盒（invitrogen，superscriptIII逆转录试剂盒）。　　1.2方法　　1.2.1细胞周期测定细胞培养至80％～90％融汇时，彻底收集细胞入15ml离心管

4、，1500rpm,5min离心,去上清得细胞沉淀。再按细胞周期流式检测试剂盒说明进行操作。EXPO32ADC软件进行检测（美国BeckmanClouter），Multicycleforan,Clouter）软件行细胞周期分析。　　1.2.2RTPCR法检测p16INK4a及p21MLV200u、RNaseInhibitor40u、10mmol/LdNTPs1μl、0.1mmol/LDTT2μl、5×RTbuffer4μl。65℃变性5min后，37℃温育50min后，70℃、15min后终止反

5、应。　　PCR反应：反应体系为20μl,分别含cDNA模板2.0μl、TaqE0.4μl、dNTP0.25mmol/L、引物1.0μl、10×PCRBuffer2.0μl。反应条件：94℃5min,94℃30s,56～62℃30s,72℃40s,35个循环;最后72℃延伸10min。其中βActin退火温度为62℃；p16INK4a退火温度为56℃；p21in电泳，EB染色，以GELDOC2000型紫外凝胶成像系统拍照，对特异基因条带进行灰度扫描，并对各特异基因/βactin的比值进行分析。

6、　　1.3统计处理测定值以均数±标准差表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析。多组间比较方差齐性时行单因素方差分析,LSD方法进行多组间两两比较；方差不齐时,采用非参数分析进行多组间比较，Dunt’sT3方法进行多组间两两比较，以P≤0.05定为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1细胞周期由表1可见，56代较30代2BS细胞G0/G1期细胞比例增加(P<0.001),而120mg/dl与240mg/dl含花粉血清培养基处理组细胞均较衰老模型组G0/G1期细胞比例减少(P<0.05

7、)。　　表1松花粉对2BS细胞细胞周期的影响（略）　　与56代对照组比较，*P≤0.05，**P≤0.01，***P≤0.001；△非参数方法（Kruskalg/dl含松花粉血清组；4.240mg/dl含花粉血清组。　　2.2.2p16INK4a及p21RNA水平p16INK4a和p21g/dl(0.3483±0.0078）与240mg/dl（0.3222±0.0055）含花粉血清组较衰老模型组（0.3974±0.0078）中p16INK4amRNA表达量均显著下调（P<0.05）。p21

8、RNA表达量在120mg/dl（0.7692±0.1749）与240mg/dl（0.4451±0.0363）含花粉血清组较衰老模型组（1.1767±0.2782）也显著下调（P<0.05）。　　本研究采用自然衰老2BS细胞模型，观察松花粉的抗衰老作用，结果显示松花粉干预能明显改善衰老细胞出现的G1期细胞阻滞，提示松花粉在体外具有一定的抗细胞复制性衰老的作用。因此本研究进一步观察了细胞周期调控蛋白p16，p21在此过程中的可能作用。　　在衰老细胞中，其细胞周期蛋白（cyclin