松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因

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1、松花粉对人胚肺二倍体成纤维细胞p16及p21基因【摘要】［目的］研究松花粉对衰老细胞(2BS)内细胞周期蛋白激酶抑制剂p16INK4a及p21ethod］The2BScells28populationdoubling(PD)anddividedequallyintotheyoungcontrolgroup,oldcontrolgroup,middledosepinepollengroup(120mg/dl)andhighdosepinepollengroup(240mg/dl)randomly.Regulate

2、thephasesofcellcyclebyfloetry，andthentheexpressionofp16INK4a，p21EM培养基中，37℃,5%CO2，饱和湿度培养箱中生长。细胞寿限为60～70代。至30代时随机取8瓶作为年轻对照组，至56代时随机取24瓶分成衰老模型组、松花粉中剂量组、松花粉高剂量组3组每组8瓶，分别以单纯完全培养基、120mg/dl含花粉血清培养基、240mg/dl的含花粉血清培养基培养8天［3］，收集细胞。配制松花粉血清液，使其终浓度分别为120mg/dl与240mg/dl。　　1.

3、1.2仪器与试剂FACScan流式细胞仪(Beckmancoulter);PCR仪（ABI9700）；凝胶成像仪（BioRad）。类标准胎牛血清（FBS）购自民海生物，MEM培养基（含非必需氨基酸、谷胺酰胺）为invitrogen产品。流式细胞周期检测试剂盒（上海杰美）；cDNA试剂盒（invitrogen，superscriptIII逆转录试剂盒）。　　1.2方法　　1.2.1细胞周期测定细胞培养至80％～90％融汇时，彻底收集细胞入15ml离心管，1500rpm,5min离心,去上清得细胞沉淀。再按细胞周期流

4、式检测试剂盒说明进行操作。EXPO32ADC软件进行检测（美国BeckmanClouter），Multicycleforan,Clouter）软件行细胞周期分析。　　1.2.2RTPCR法检测p16INK4a及p21MLV200u、RNaseInhibitor40u、10mmol/LdNTPs1μl、0.1mmol/LDTT2μl、5×RTbuffer4μl。65℃变性5min后，37℃温育50min后，70℃、15min后终止反应。　　PCR反应：反应体系为20μl,分别含cDNA模板2.0μl、TaqE0.

5、4μl、dNTP0.25mmol/L、引物1.0μl、10×PCRBuffer2.0μl。反应条件：94℃5min,94℃30s,56～62℃30s,72℃40s,35个循环;最后72℃延伸10min。其中βActin退火温度为62℃；p16INK4a退火温度为56℃；p21期的顺序进行，细胞周期具有G1/S与G2/M两个调控点，其中G1/S点是启动细胞周期循环的关键。细胞衰老最显著的特征是细胞在很长一段时间内仍维持代谢活性，但因阻滞于G1期，失去了对有丝分裂原的反应和合成DNA的能力，不能进入S期。　　本研究采

6、用自然衰老2BS细胞模型，观察松花粉的抗衰老作用，结果显示松花粉干预能明显改善衰老细胞出现的G1期细胞阻滞，提示松花粉在体外具有一定的抗细胞复制性衰老的作用。因此本研究进一步观察了细胞周期调控蛋白p16，p21在此过程中的可能作用。　　在衰老细胞中，其细胞周期蛋白（cyclin）、细胞周期蛋白依赖激酶（CDK）、细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子(CDKI)发生量与活性的变化。依据激活的CDKI的不同，可将衰老通路分为以下三条［6］，包括p16INK4a/RB,p19ARF/p53/p21anK等学者提出P16能作为测定

7、细胞衰老的分子标记以区别于单从时间上对衰老的界定［10］。国内Jiangming等以p16正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞（2BS）［11］，结果示p16INK4a的积累是衰老的诱因，而不是衰老的结果。进一步研究发现［12］，负调控机制减弱是细胞复制性衰老时p16INK4a基因高表达的重要原因。　　本研究观察松花粉抗细胞衰老过程中p16表达的变化，发现在松花粉干预处理后衰老细胞的p16INK4amRNA表达量出现明显的下调。提示松花粉有可能通过抑制p16INK4a的表达，解除对Rb活性的抑制，促进E2F蛋白的释

8、放，激活E2F依赖的G1晚期调控蛋白，促进细胞DNA增殖，改善G1期阻滞。但是松花粉对p16INK4a的抑制作用是否与激活其负调控元件有关还有待于进一步的研究。　　P21olCellBiol，1996，16:859.　　［9］AlcortaDA，XiongY,PhelpsD，etal.Involvementofthecyclin2dependentkinas