大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用及机

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1、大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤的保护作用及机【摘要】目的:观察中药大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤是否具有保护作用，探讨其可能的保护机制.方法:体外培养肝细胞株HL7702，随机分为对照组和大黄素处理组.对照组未予大黄素处理，大黄素处理组分为100，10，1μmol/L3个浓度组，建造模拟冷缺血再灌注模型，分别检测各组上清液中乳酸脱氢酶（LDH），细胞内超氧化物岐化酶（SOD）和丙二醛（MDA）水平；流式细胞技术检测细胞内活性氧（ROS）水平.结果:冷缺血8h再灌注6h后，中、高浓度大黄素处理组LDH分别为（198.83±14.22）U/L，（179.67±18.57）U/L，显

2、著低于对照组的（351.33±34.16）U/L（P<0.01）；MDA分别为（7.80±0.88）μmol/L，（4.97±0.71）μmol/L，显著低于对照组的（16.67±1.14）μmol/L（P<0.01）；SOD分别为（14.32±1.53）×103U/L，（18.64±1.38）×103U/L，显著高于对照组的（8.56±0.94）×103U/L（P<0.01）.高、中、低浓度大黄素处理组ROS阳性细胞率分别为0.1140±0.0037，0.1599±0.0039，0.9527±0.0080，均低于对照组的0.9974±0.0006（P<0.01）

3、；各浓度大黄素处理组之间差异具有统计学意义（P<0.05）.结论:大黄素对肝细胞模拟冷缺血再灌注损伤具有保护作用，其保护机制可能与清除氧自由基，降低细胞内活性氧水平有关.【关键词】大黄素肝细胞再灌注损伤　　1材料和方法　　1.1材料肝细胞株HL7702（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）；RPMI(RosorialInstitute)1640培养基（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程研究所）；混合气体950mL/LN2－40mL/LCO2－10mL/LO2（西安交通大学医学院后勤中心）；大黄素，2,7二氯荧光素二脂(2,7dichlorofluoresc

4、indiacetate,DCFHDA)荧光探针（美国Sigma公司）；乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH），超氧化物岐化酶（superoxidedismutase，SOD）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）；流式细胞仪（FACSCabuliburTM,美国贝克曼库尔特有限公司）；Olympus倒置显微镜（IX7081FZ，日本Olympus公司）.　　1.2方法　　1.2.1冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组模拟冷缺血再灌注模型参照文献［4］的方法并加以改进：①肝细胞HL7702体外培养至对数生长期，

5、等量均匀接种于6孔板或25mL培养瓶中，给予大黄素干预，按100，10，1μmol/L分为高、中、低浓度组和对照组（未予大黄素干预），培养24h准备实验.②模拟缺血：将培养液吸弃，等体积加入模拟缺血溶液（NaCl98.5mmol/L，KCl10mmol/L，NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO36.0mmol/L，CaCl21.8mmol/L，MgSO41.2mmol/L，乳酸钠40mmol/L，HEPES20mmol/L，pH6.8，4℃）.再将培养容器放入缺氧培养装置中，充入混合气体(950mL/LN2－40mL/LCO2－10mL/LO2)，待氧分压≤1%时，同时关闭进气口

6、与出气口，放入4℃冰箱保存8h.③模拟再灌注：取出培养容器，吸弃模拟缺血溶液，等体积加入模拟再灌注液（NaCl129.5mmol/L，KCl5.0mmol/L，NaH2PO40.9mmol/L，NaHCO320mmol/L，CaCl21.8mmol/L，MgSO41.2mmol/L，葡萄糖55mmol/L，HEPES20mmol/L，pH7.4，37℃），放入50mL/LCO2孵箱中37℃培养6h.　　1.2.2细胞形态学、LDH,SOD,MDA及细胞内活性氧水平检测倒置显微镜观察单纯冷缺血与再灌注后细胞形态学变化.上清液LDH含量及细胞内SOD,MDA水平严格按照试剂盒说明书操作检测.

7、DCFHDA荧光探针负载细胞检测细胞内ROS水平，终浓度10μmol/L，37℃避光孵育30min，PBS洗涤3遍，消化至悬，流式细胞仪分析结果，阳性细胞百分率和平均荧光强度代表ROS水平.　　统计学处理：数据结果用表示.采用SPSS13.0进行统计分析.统计方法采用单因素方差分析，多重比较用LSDt检验.P<0.05为差异具有统计学意义.　　2结果　　2.1倒置显微镜下细胞形态学改变再灌注后6h细胞形态较单纯冷缺血8h时