大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响

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1、大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响：祁翔，吕毅，沈乃营，刘昌，刘学民，王博祁翔【摘要】目的研究中药大黄素对模拟冷缺血再灌注后肝细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响。方法体外培养肝细胞株HL7702，随机分为对照组和大黄素处理组。对照组未予大黄素处理，大黄素处理组按100、10、1μmol/L分为高、中、低3个浓度组，建立模拟冷缺血再灌注模型，流式细胞技术检测各组细胞内钙离子浓度及细胞凋亡水平，分别检测各组细胞培养上清液乳酸脱氢酶水平。结果冷缺血8h再灌注6h后，高、中、低浓度大黄素处理组钙离子荧光强度分别为(24.12±0.51)、(26.35±

2、1.34)、(39.12±1.94)，均显著低于对照组的105.29±1.01(P<0.01)。高、中、低浓度大黄素处理组细胞凋亡率分别为(5.46±0.41)%、(10.64±0.64)%、(11.90±0.50)%，均显著低于对照组的(25.40±1.41)%(P<0.01)。高、中浓度大黄素处理组上清液LDH含量分别为(179.67±18.57)u/L、(198.83±14.22)u/L，显著低于对照组的(351.33±34.16)u/L(P<0.01)。结论大黄素可降低模拟冷缺血再灌注后的肝细胞内钙离子浓度，抑制细胞凋亡，减轻肝细胞损伤。【关键

3、词】大黄素；肝细胞；冷缺血再灌注；细胞内钙离子浓度；凋亡　　ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheeffectofEmodinonintracellularcalciumconcentration([Ca2+]i)andapoptosisofhepaticcellsaftersimulatedcoldischemiareperfusion.MethodsGlucoseoxygendeprivation,loperature,subsequentreoxygenationandreingiareperfusioninjurymodeli

4、nculturedhepaticcellsodintreatedgroup(100,10and1μmol/Lgroups).Theintracellularcalciumconcentration([Ca2+]i)andapoptosisrateinedbyfloetry(FCM)respectively;thecontentoflactatedehydrogenase(LDH)insupernatantfluorescenceintensityinEmodintreatedgroupsofhigh,mediumandloodintreatedgroupsofhi

5、gh,mediumandloodintreatedgroupsofmediumandhighdensityrespectively,odincouldreduce[Ca2+]iandinhibitapoptosisofhepaticcellsaftersimulatedcoldischemiareperfusion,thusprotectinghepaticcellseffectively.　　KEYI1640培养基为美国Gibco公司产品；胎牛血清由杭州四季青生物工程研究所提供；混合气体95%N24%CO21%O2由西安交通大学医学院后勤中心提供；大黄素、An

6、nexinⅴ凋亡试剂盒为美国SIGMA公司产品。AO/EB凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司。Fluo3/AM钙离子荧光探针为美国Biotium公司产品；LDH检测试剂盒由南京建成生物工程研究所提供。流式细胞仪型号FACSCabuliburTMUSA，Olympus荧光显微镜型号BX51TR32FB3E01Japan。　　1.2冷缺血再灌注损伤模型的建立及实验分组　　模拟冷缺血再灌注模型参照文献[6]的方法并加以改进：①肝细胞HL7702体外培养至对数生长期，等量均匀接种于6孔板或25mL培养瓶中，给予大黄素干预，按100、10、1μmol/L分为高

7、、中、低浓度组和对照组(未予大黄素干预)，培养24h准备实验；②模拟缺血：将培养液吸弃，等体积加入模拟缺血溶液(NaCl98.5mmol/L、KCl10mmol/L、NaH2PO40.9mmol/L、NaHCO36.0mmol/L、CaCl21.8mmol/L、MgSO41.2mmol/L、乳酸钠40mmol/L、HEPES20mmol/L，pH6.8，4℃)，并给予大黄素干预。再将培养容器放入缺氧培养装置中，充入混合气体(95%N24%CO21%O2)，待氧分压≤1%时，同时关闭进气口与出气口，放入4℃冰箱保存8h；③模拟再灌注：取