takara反转录试剂盒说明书.pdf

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1、CodeNo.RR047A研究用PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser(PerfectRealTime)说明书v201512Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●试剂盒外必备材料1●保存1●特长2●使用注意2●操作方法2●RealTimePCR4●实验例6●附录7●关联产品8●制品说明为了准确地进行基因表达量分析，必须满足只有cDNA作为模板检出的先决条件，但TotalRNA中常常混有基因组DNA，并可以直接作为PCR反应的模板进行扩增，因此会造成解析结果不准确。为了避免这种情况发生

2、，通常将检测用引物设计在内含子前后的外显子上，使基因组DNA得不到扩增。但是，此方法不适合具有单个外显子的基因或两个外显子之间所跨的内含子过小的基因，同时当基因组上有伪基因存在时、或设计引物对基因组有非特异性扩增时、以及基因信息没被完全解析的生物种等也同样不适合于本方法。在这种情况下，我们常常需要对TotalRNA样品进行DNaseI处理，以除去残存的基因组DNA。而DNaseI处理通常要进行复杂的纯化操作，同时会造成RNA的降解和损失。PrimeScriptRTreagentKitwithgDNAEraser是可以除去基因

3、组DNA进行RealTimeRT-PCR反应的专用反转录试剂。Kit中使用了具有较强DNA分解活性的gDNAEraser，通过42℃，2min即可除去基因组DNA。同时由于反转录试剂中含有抑制DNA分解酶活性的组分，经过gDNAEraser处理后的样品可以直接进行15min的反转录反应合成cDNA，因此，20min内即可迅速完成从基因组DNA去除到cDNA合成的全过程。®®使用本制品合成的cDNA适用于SYBRGreen分析法和TaqMan探针分析法，可以根据实验目的，选择与SYBRPremixExTaq™II（TliRNa

4、seHPlus）（CodeNo.RR820Q/A/B）、ProbeqPCRMix（CodeNo.RR391S/A/B）组合使用。®注意：TakaraBio使用SYBRGreenI作为研究试剂已得到MolecularProbesInc.的许可。®SYBR为MolecularProbesInc.的注册商标。●制品内容（20μl反应×100次）1.gDNAEraser100μl*12.5×gDNAEraserBuffer200μl*23.PrimeScriptRTEnzymeMixI100μl*34.5×PrimeScriptBu

5、ffer2（forRealTime）400μl*45.RTPrimerMix400μl6.RNaseFreedH2O1ml×2*57.EASYDilution（forRealTimePCR）1ml*1：5×gDNAEraserBuffer在反转录反应前使用，请务必进行基因组DNA的除去反应。*2：含有RNaseInhibitor。*3：含有dNTPMixture。*4：含有OligodTPrimer和Random6mers。*5：制作标准曲线时梯度稀释cDNA或RNA标准品的稀释液。模板DNA或RNA如果用水或TEBuffe

6、r稀释时，由于受Microtube吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，导致实验结果精度降低。使用本制品时，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线。本制品不影响反转录和PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用。EASYDilution（forRealTimePCR）（CodeNo.9160）也可以单独购买。注意：EASYDilution（forRealTimePCR）请与本公司RealTimePCR试剂组合使用，对于其他公司的同类制品的适用性本公司尚未进行确认。●试剂盒外必备材料热循环

7、仪（或37℃水浴，42℃水浴和85℃加热块）反转录反应所用0.2ml和1.5ml的微量反应管微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。-1-●特长1．含有去除基因组DNA的gDNAEraser，只需2min即可除去基因组DNA。2．只需15min即可高效合成RealTimePCR反应用模板cDNA，是进行2StepRealTimeRT-PCR反应的最佳试剂。3．反转录引物使用了Random6mers和OligodTPrimer混合的RTPrimerMix，可以均匀合成样品中的各种cDNA。4．本制品提供了SYBRGree

8、n分析法和TaqMan探针分析法各自最适反应体系，可以根据分析方法选择体系。SYBRGreen分析法和TaqMan探针分析法区别如下：反转录反应中RTPrimerMix的用量。反转录反应中总RNA的用量。5．RealTimeRTPCR定量需要建立标准曲线，建立标准曲线的条件就是需要将总