逆转录试剂盒说明书

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1、CodeNo.6110A研究用PrimeScript™1stStrandcDNASynthesisKit说明书v201606Da目录内容页码●制品说明1●制品内容1●本Kit以外需准备的主要试剂及仪器1●保存1●1stStrandcDNA合成反应1●RT-PCR及RealTimeRT-PCR反应2●注意事项2●关联产品3●制品说明+本制品是使用PrimeScriptRTase从TotalRNA或PolyARNA合成1stStrandcDNA的试剂盒，含有1stStrandcDNA合成所需的全部试剂。PrimeScriptReverseTra

2、nscriptase是一种MMLV(MoloneyMurineLeukemiavirus)由来的新型反转录酶。本酶能够有效合成长达12kb的1stStrandcDNA，即使对富含GC的片段或者具有复杂二级结构的RNA，在常规的反转录温度42℃条件下也能得到良好的反转录效果，无需进行高温反转录反应（高温反转录反应会导致RNA的降解）。合成的1stStrandcDNA可广泛应用于2ndStrand合成、杂交、PCR扩增、RealTimePCR反应等。●制品内容（50次量）1.PrimeScriptRTase（200U/μl）50μl2.5×Pr

3、imeScriptBuffer200μl3.RNaseInhibitor（40U/μl）25μl4.dNTPMixture（10mMeach）50μl5.OligodTPrimer（50μM）50μl6.Random6mers（50μM）100μl7.RNasefreeH2O1ml【引物序列】引物名称各引物序列Random6merspd(N)6OligodTPrimerTakara特别开发的dT序列**该序列和TaKaRaRNAPCR™Kit(AMV)Ver.3.0(CodeNo.RR019A/B)的OligodTAdaptorPrimer

4、不同，不含有M13PrimerM4匹配的序列。●本Kit以外需准备的主要试剂及仪器1.水浴锅2.DNA扩增仪TaKaRaPCRThermalCyclerDice™Gradient(CodeNo.TP600)。3.电泳用凝胶AgaroseL03[TAKARA](CodeNo.5003),PrimeGel™AgarosePCR-Sieve(CodeNo.5810A),etc.4.电泳仪5.微量离心机6.微量移液器和枪头（高压灭菌）●保存：-20℃。●1ststrandcDNA合成反应1.按下表配制反应液：试剂使用量OligodTPrimer（5

5、0μM）1μl*1[或Random6mers（50μM）]或1μl（0.4-2μl）dNTPMixture（10mMeach）1μl*2totalRNA：<5μgTemplateRNA+PolyARNA：<1μgRNasefreedH2Oupto10μl-1-*32.65℃保温5min后，冰上迅速冷却。3.按下表配制20μl反应液：试剂使用量上述变性后反应液10μl5×PrimeScriptBuffer4μlRNaseInhibitor（40U/μl）0.5μl（20units）PrimeScriptRTase（200U/μl）1μl（20

6、0units）RNasefreedH2Oupto20μl4.缓慢混匀。5.按下列条件进行反转录反应：30℃10min.（使用Random6mers时）*442℃（50℃）30-60min.*56.95℃保温5min.使酶失活，冰上放置。*1：为获得良好的实验结果，2kb以上的长片段cDNA合成时，Random6mers的使用量为0.4μl（20pmol），RealTimePCR反应时，Random6mers的使用量为2μl(100pmol)。也可以使用GeneSpecificPrimer，此时引物终浓度为0.1μM。*2：RealTimeR

7、T-PCR反应时，TotalRNA的使用量不超过1μg。*3：模板RNA的变性步骤对于提高反转录效率很重要。*4：通常情况下在42℃进行反转录反应。但当反转录引物使用PCR的下游引物时，为了减少由于引物错配等引起的非特异性扩增，将反转录温度设为50℃。*5：长片段cDNA扩增时，为了保证1ststrandcDNA的完整性，请进行70℃、15min.失活处理。●RT-PCR及RealTimeRT-PCR反应1stStrandcDNA合成反应液无需纯化，可以直接作为PCR、RealTimePCR反应用的模板。但是1stStrandcDNA合成反

8、应液的添加量不要超过PCR反应体系的1/10。模板量会影响酶的扩增效率。因此需参照PCR酶的操作方法选择合适的模板量。若PCR扩增后有非特异性条带或者没有扩增产物，将cDNA合成