TaKaRa-染色体步移试剂盒说明书.pdf

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1、TakaraCode：D316GenomeWalkingKit（10次量）说明书宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存2●试剂盒原理2●特异性引物的设计3●实验时需要自备的其他主要试剂3●实验操作流程3●实验操作方法4●注意事项6●使用ControlTemplate时的实验例6●使用小麦基因组DNA时的实验例8●Q&A10●参考文献11●制品说明染色体步移技术（GenomeWalking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1.根据已知的基因或分子标记连续步

2、移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2.步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3.鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4.用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5.用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域

3、两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。以PCR技术为基础的染色体步移的主要问题是在预先不了解未知区域序列信息的情况下，如何设计两个特异性引物来扩增未知区域。而传统的染色体步移方法，如：反向PCR法、连接接头法等，都有操作复杂、非特异性扩增、连接效率低等弊端。本试剂盒是一种根据已知基因组DNA序列，高效获取侧翼未知序列的试剂盒。相对于其它传统方法，本试剂盒具有高效、简便、特异性高、灵敏度高、一次性获得的未知序列较长等特点。其主要原理是根据已知DNA序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SPPrimer），与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的兼并

4、引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应。通常情况下，其中至少有一种兼并引物可以与特异性引物之间利用退火温度的差异进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应即可获取已知序列的侧翼序列。如果一次实验获取的长度不能满足实验要求时，还可以根据第一次步移获取的序列信息，继续进行侧翼序列获取。此外，本试剂盒中还含有ControlDNA及ControlPrimer，可以方便进行Control实验。●制品内容（10次量）1.AP1Primer（100pmol/μl）30μl2.AP2Primer（100pmol/μl）30μl3.AP3Primer（100pm

5、ol/μl）30μl4.AP4Primer（100pmol/μl）50μl5.ControlTemplate（100ng/μl）*110μl6.ControlSpecificPrimerSP1（10pmol/μl）*210μl7.ControlSpecificPrimerSP2（10pmol/μl）*210μl8.ControlSpecificPrimerSP3（10pmol/μl）*210μl9.TaKaRaLATaq®（5U/μl）25μl10.10×LAPCRBufferII（Mg2+plus）1ml11.dNTPMixture（2.5mMeach）400μl

6、12.6×LoadingBuffer1ml*1ControlTemplate是HumanHL60来源的基因组DNA。*2ControlSpecificPrimers是根据人基因组中的ALDOA基因设计的特异性引物。【引物序列】引物名称引物序列（5’→3’）ControlSpecificPrimerSP1AAATGCTGCAGCCTCCCTCTCACCCControlSpecificPrimerSP2AATACCAGAAATGTGCCCTCCCGTGControlSpecificPrimerSP3TGAGCTGGCAGGTTGTAGTCTCTGT-1-●保存：-20℃。●

7、试剂盒原理:以使用兼并引物AP1为例。图1.GenomeWalkingKit的实验原理图-2-●特异性引物的设计要求特异性引物设计示意图(以获取5‘序列为例)未知区域已知序列区5`3`APPrimerBindingSite3`5`A．SP3SP2SP1特异性引物图2.GenomeWalkingKit特异性引物设计示意图特异性引物设计原则：根据经过验证的已知序列区（最好不少于500bp）设计三个特异性引物（见上图）：设计方向为需要扩增的未知区域方向，SP2的位置应设计在SP1的内侧，SP3位于SP2的内侧。每两个引物之间的距离没有严格规定，