n-甲基-d天冬氨酸受体2b亚基镇痛疫苗构建及其镇痛效应的研究

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1、华中科技大学博士学位论文中文摘要N－甲基－D－天冬氨酸受体2B亚基镇痛疫苗的构建及其镇痛效应的研究博士研究生：王公明博士生导师：田玉科教授华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学教研室研究背景神经病理性疼痛是神经系统原发性损伤或功能异常所导致的痛觉异常或痛觉过敏。创伤、缺血性损伤、感染或炎症、肿瘤、药物和压迫等原因均可以引起神经病理性疼痛。非甾体类抗炎药和阿片类镇痛药治疗神经病理性疼痛的效果差，临床上常使用三环类抗抑郁药和抗癫痫药物进行治疗，但疗效差，副作用大，能够有效缓解50％以上疼痛症状的患者不足50％。因此寻找一种安全有效、作用持久的镇痛方法已成为神经

2、病理性疼痛研究的重要方向。神经病理性痛的受体机制研究表明，神经元和神经胶质细胞膜上的N-甲基－D－天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartatereceptor，NMDAR）表达上调或过度激活可引起中枢敏感化，在神经病理性痛的产生如自发性痛，触诱发痛及痛觉过敏等起重要作用。NMDA受体拮抗机如氯胺酮、MK-801等对神经病理性痛具有良好的镇痛作用，但由于这些药物具有如认知功能障碍、神经空泡样改变等副作用等限制了它们的临床应用。近期的研究表明，NMDA受体的亚型——NR2B型NMDA受体（NR2B）在体内呈选择性分布如主要分布于脊髓背角、前脑等与痛传递

3、和痛情绪有关的区域，与痛感觉和痛情绪的形成密切相关，这提示NR2B可能是一个潜在的镇痛治疗的靶点。现在疫苗技术的发展不仅针对外源性抗原开发出各种疫苗，而且能对机体自身抗原制备特异性疫苗，如最近利用肿瘤细胞表面的特异性位点研制的疫苗已被证实能有效地预防和治疗癌症地发生发展。During等构建的NMDAR1表位疫苗为防治中风和癫痫后脑损伤提供了新的治疗策略。据此，我们的假设：以NR2B为抗2华中科技大学博士学位论文原制备疫苗诱导机体产生NR2B抗体，该抗体与神经元或胶质细胞膜上的NR2B结合，下调NR2B的表达或阻断NR2B的激活，发挥镇痛作用。因此，本研究旨在

4、首先观察NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的免疫效应及镇痛效应，然后构建NR2B重组腺病毒(Recombinantadenovirusserotype5encodingNR2Bgene,rAd5/NR2B)镇痛疫苗，并通过口服免疫大鼠，以评价其对大鼠神经病理性痛痛感觉和痛情绪的影响。研究方法与结果1、NR2B多肽疫苗对神经病理性痛大鼠的免疫效应及超前镇痛效应方法：选取NR2B有免疫原性的一段氨基酸序列合成多肽，并与大分子蛋白载体匙孔虫戚血蓝蛋白(KeyholeLimpetHemocyanin,KLH)交联制备NR2B多肽疫苗即NR2B-KLH。健康雌性SD大

5、鼠随机分为三组：PBS组、KLH组及NR2B组。分别用PBS＋福氏佐剂，KLH＋福氏佐剂和NR2B-KLH＋福氏佐剂皮下注射三次，每次注射后两周以间接ELISA法检测受免大鼠血清NR2B特异性抗体的滴度，并以免疫组化染色法检测大鼠免疫血清与脊髓背角NR2B蛋白的免疫结合反应。于第三次免疫后一周结扎坐骨神经的胫神经和腓总神经分支，保留腓肠神经分支，建立SD大鼠保留神经损伤性神经病理性痛模型（Sparednerveinjury,SNI）。术后隔日以up-down法检测大鼠术侧后爪50％机械缩爪阈值的变化及热痛缩爪时间的变化。分别于术前一天和术后7天经枕骨大孔取脑

6、脊液（cerebrospinalfluid,CSF）10～20μl，以间接ELISA法检测CSF中NR2B抗体滴度。术后7天处死大鼠，取腰段脊髓（L4~6），以免疫组化染色法检测脊髓背角c-Fos阳性神经元数目，并采用Westernblotting法检测脊髓背角NR2B蛋白的改变。结果：第二次注射后，NR2B组9只大鼠有6只大鼠出现NR2B抗体（＞0.5μg/ml）。第三次注射后9只大鼠均检测到NR2B抗体（＞2.2μg/ml），且滴度较第一次明显升高。在第三次注射后14天抗体滴度最高（7.2μg/ml），随后抗体滴度逐渐降低，但初次注射后70天血清仍可检测

7、到NR2B抗体。而PBS组和KLH组未检测到NR2B抗体。免疫组化染色法检测发现NR2B大鼠血清可与大鼠脊髓背角结合呈阳性3华中科技大学博士学位论文着色，而其余两组未见着色。与术前比较，术后第7天PBS、KLH及NR2B各组50％缩爪阈值均明显降低（P＜0.05）；但各组间比较，NR2B组明显高于其余两对照组（P＜0.05）。各组术后7天热痛缩爪时间与术前比较均有显著升高（P＜0.05），但各组间比较，NR2B组明显低于其余两对照组（P＜0.05）。术后7天脊髓背角c-Fos蛋白阳性神经元的数目NR2B组明显低于两对照组（P＜0.05）(NR2B组：170±

8、22，PBS组：301±36，KLH组：280±25