温肾健脾方对大鼠慢性创面愈合的影响

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　　温肾健脾方对大鼠慢性创面愈合的影响：曹永清，何春梅，陆金根【关键词】创面愈合［摘要］目的：探讨温肾健脾中药对慢性创面愈合的影响及可能作用机制。方法：采用大鼠背部开放性创面模型，用肌注氢化可的松的方法造成慢性难愈性创面，以辛葡康为阳性对照药，应用免疫组化、流式细胞术等方法，观察创面愈合时间、新生上皮宽度、肉芽组织形态学变化、肉芽组织细胞周期、表皮生长因子(epidermalgroinggrom，较模型组及空白组明显增宽（P<0.05）；治疗组新生毛细血管丰富，成纤维细胞数量多，而对照组、模型组及空白组新生毛细血管及成纤维细胞数量均较治疗组明显减少（P<0.05）；治疗组S期细胞比例较对照组、模型组及空白组明显提高（P<0.05）；治疗组及对照组与模型组及空白组比较，EGF、TGFβ1、FN蛋白表达均增强（P<0.05）。结论：温肾健脾方有促进大鼠慢性难愈创面修复的作用，其机制与调节细胞周期，上调EGF、TGFβ1细胞因子蛋白表达水平，促进间质FN的表达有关。［关键词］中药疗法;创面愈合;肉芽组织;组织学比较;细胞因子 Effectsofethods:NiysixSDratslydividedinto4groups,adeintherats.Forratsin3ofthe4groups,hydrocortisoneinjectioninisteredtoinducechroniceandtheisorphologicalchangesandcellcycleofthegranulationtissue,andtheproteinexpressionsofepidermalgroinggromunohistochemicaltechniqueandfloetry.Results:Theeofthe;l的中药水煎浓缩液，备用。辛葡康冲剂由杭康生物药业有限公司生产，批号20010211。1.1.3实验试剂与仪器氢化可的松琥珀酸钠，50mg/支，天津市生物化学制药厂生产，批号20010419；表皮生长因子(epidermalgroinggropus公司产品；流式细胞仪，美国BectonDickson公司产品。1.2造模方法参照傅小兵等［1］全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型。SD大鼠常规饲养1周后，腹腔注射盐酸氯胺酮150mg/kg，麻醉后造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径20mm塑料瓶盖在造模区标记造模面积，新洁而灭酊棉球皮肤消毒，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，止血，消毒纱布敷料覆盖伤口，分笼单独饲养，自由进食饮水。次日起，模型组、治疗组及对照组均肌注氢化可的松琥珀酸钠100mg/kg，隔日1次，共注射7次。1.3动物分组及给药 1.3.1动物分组采用完全随机方法分组。每组24只大鼠，共分四组，即温肾健脾方实验组（以下简称治疗组）、辛葡康阳性对照组（简称对照组）、模型组，以上3组背部造成创面后，均肌注氢化可的松琥珀酸钠；空白组(正常创面组)，造模后不作处理。1.3.2给药及取材给药剂量按《中药药理实验方法学》［2］中人鼠等效剂量换算，治疗组自造模次日起以温肾健脾方中药水煎剂灌胃，2ml/次，1次/d；对照组以0.1g/ml辛葡康冲剂灌胃，2ml/次，1次/d；模型组及空白组均以等量生理盐水灌胃。各组均分两次取材。灌胃至第7天，每组各取8只动物处死后，取创面修复组织（主要是新生肉芽组织），一分为二，分别放置于新鲜生理盐水及10%中性甲醛固定液中，一部分做细胞周期测定，另一部分用于形态学观察及免疫组化法检测肉芽组织中EGF、TGFβ1表达。灌胃至第14天，取8只动物处死，测量新生上皮宽度，并取创面肉芽组织，10%中性甲醛固定，免疫组化法检测肉芽组织中FN的表达。其余8只继续灌胃至创面愈合。1.4观察指标与方法1.4.1创面愈合时间造模之日起至创面愈合所需的时间。1.4.2新生上皮宽度灌胃14 d后，测量各组新生上皮的宽度。沿创缘前后及创缘左右各取4点（每点相对于创面中点的连线各成90o），用游标卡尺测量各点新生上皮的宽度，取平均值。1.4.3形态学观察造模后第8天创面中央肉芽组织取材，生理盐水冲净血污，10%中性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约5mm，常规HE染色，光学显微镜观察每高倍（10×40）视野下各组肉芽组织毛细血管（完整管腔）、纤维母细胞数及坏死程度，并用计分法表示，计分标准如下。毛细血管：无，计0分；1~5个，计1分；6~10个，计2分；>10个，计3分。纤维母细胞：无，计0分；1~30个，计1分；31~50个，计2分；>50个，计3分。坏死程度：无坏死，计0分；坏死少，计1分；坏死较多，计2分；坏死多，计3分。1.4.4肉芽组织细胞周期测定造模后第8天创面中央肉芽组织取材，新鲜组织置于生理盐水中，样品处理后制成单细胞悬液，碘化丙啶标记，避光静置30min，流式细胞仪检测，自动拟合出细胞周期各时相比例。1.4.5免疫组化ABC法检测EGF、TGFβ1和FN表达标本甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约5μm，脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次5min,柠檬酸缓冲液微波处理，92～100oC，10min,PBS冲洗3次，每次5min,每片加1滴第一抗体，37oC，90min,PBS冲洗3次，每次5 min,滴加Envision试剂，室温下放置60min,PBS冲洗3次，每次5min,滴加新配制的DAB显色液，显微镜下控制显色3～10min,自来水冲洗，苏木素复染45s，中性树胶封片。显微镜下观察，有棕黄染色者为阳性。采用Leica全自动图像分析系统，对各组免疫组化切片进行图像分析。根据各组切片中染色条件，在统一阈值下进行。（1）输入图像：在200倍显微镜下，每张切片随机选取3个视野。（2）测量参数：测定各组在统一光度下阳性细胞的积分光密度（integralopticaldensity,IOD）。2.2大鼠造模后第8天创面肉芽组织形态学观察每组随机抽取6张切片，光镜下观察造模后第8天创面修复组织，见治疗组新生毛细血管丰富，成纤维细胞数量多，炎细胞浸润少，而对照组、模型组及空白组新生毛细血管及成纤维细胞数量均较治疗组明显减少，差别有统计学意义（P<0.05）。见表2。2.3大鼠造模后第8天创面肉芽组织细胞周期测定治疗组S期细胞比例较对照组、模型组及空白组明显提高(P<0.05)，其中模型组S期细胞比例最低。见表3。2.4大鼠造模后第8天创面肉芽组织EGF、TGFβ1及第14天创面FN蛋白表达每组8个标本中随机挑选4个做EGF、TGFβ 1及FN的免疫组化和图像分析，观察阳性细胞的IOD，结果显示治疗组及对照组EGF、TGFβ1、FN蛋白表达均增强，两组之间无差异，而治疗组与模型组及空白组比较差异显著（P<0.05）。见表4。表1创面愈合时间及实验第14天新生上皮宽度表2创面中央肉芽组织形态学检查平均积分表3创面肉芽组织细胞周期测定表4创面肉芽组织EGF、TGFβ1和FN蛋白表达3讨论3.1氢化可的松造成慢性创面脾肾阳虚型动物模型的探讨一般认为肾上腺皮质类固醇是延迟组织修复的药物，其主要机制是抑制炎症反应、抑制胶原合成和促进蛋白分解等［3］。Broanangiogenesis［J］.LabInvest,1996,75(4):539555.5陈奇.中药药理研究方法学［M］.北京:人民卫生出版社,1993.982.6陈星伟.纤维结合蛋白在创伤愈合中的作用［J］.中华创伤杂志,1990,6(4):245247.