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1、温肾健脾方对大鼠慢性创面愈合的影响作者：曹永清，何春梅，陆金根【关键词】创而愈合［摘要］F1的：探讨温肾健脾中约对慢性创面愈合的影响及可能作用机制。方法：采用大鼠背部开放性创面模型，用肌注氢化可的松的方法造成慢性难愈性创面,以辛葡康为阳性对照药，应用免疫组化、流式细胞术等方法，观察创面愈合时间、新牛上皮宽度、肉芽组织形态学变化、肉芽组织细胞周期、表皮工长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）＞转化牛:长因了卩1（transfbnninggrowthfactoi■卩1,TGF卩1）及纤维连接蛋A（fibronect
2、in,FN）等指标。结果：温肾健脾方治疗组与辛葡康对照组平均创面愈合时间分别为（17.0±1・9）和（18.8±1.9）d,较模型组及空白组明显缩短（P1材料和方法1」实验材料1.1.1实验动物实验用清洁级SD大鼠96只，雄性，体质量180〜220g,由上海屮医药大学实验动物中心提供。1.1.2实验药物温肾健脾方由黄茂、茯苓、肉桂、当归、刺五加组成，制备成含生药1g/ml的屮药水煎浓缩液，备用。辛葡康冲剂由杭康牛物药业有限公司牛-产，批号2001021E1.1.3实验试剂与仪器氢化可的松琥珀酸钠，50mg/支，天津市生物化学制药厂牛
3、产,批号20010419；表皮生长因子（epidennalgrowthfactor,EGF）兔抗大鼠多克隆抗体，Oncogene公司产品；转化生长因了pl（transforminggrowthfactorp1,TGF［31）兔抗人鼠多克隆抗体、纤维连接蛋tl（fibronectin,FN）山羊抗人鼠多克隆抗体，Santa公口1产品；AHBT5B通用研究显微镜，Olympus公司产品；流式细胞仪，美国BectonDickson公司产品。1.2造模方法参照傅小兵等［1］全层皮肤缺损法制成动物体表溃疡模型。SD大鼠常规饲养1周后，腹腔注射
4、盐酸氯胺酮150mg/kg,麻醉后造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径20mm塑料瓶盖在造模区标记造模面积，新洁而灭酊棉球皮肤消毒，沿标记线剪去皮下组织至肌筋膜，止血，消毒纱布敷料覆盖伤口，分笼单独饲养，自由进食饮水。次口起,模型组、治疗组及对照组均肌注氢化可的松琥珀酸钠100mg/kg,隔Fl1次，共注射7次。1.3动物分组及给药1.3.1动物分组采用完全随机方法分组。每组24只大鼠，共分四组，即温肾健脾方实验组（以下简称治疗组）、辛衙康阳性对照组（简称对照组）、模型组，以上3组背部造成创面后，均肌注氢化可的松琥珀酸钠；空口组（正常
5、创面纽），造模后不作处理。1.3.2给药及取材给药剂量按《中药药理实验方法学》［2］中人鼠等效剂量换算，治疗组自造模次口起以温肾健脾方中药水煎剂灌胃，2讪/次，1次/d；对照组以0.1g/ml辛葡康冲剂灌胃，2別/次，1次/d；模型组及空白组均以等量生理盐水灌胃。各组均分两次収材。灌胃至第7天，每组各取8只动物处死后，取创而修复组织（主耍是新生肉芽组织），一分为二，分別放置丁•新鲜生理盐水及10%屮性甲醛固定液中，一部分做细胞周期测定，另一部分用于形态学观察及免疫组化法检测肉芽组织中EGF、TGF[31表达。灌胃金笫14天，取8只动
6、物处死，测量新生上皮宽度，并取创面肉芽组织，10%屮性甲醛固定，免疫组化法检测肉芽组织屮FN的表达。其余8只继续灌胃至创血愈合。1.4观察指标与方法141创血愈合时间造模之口起至创面愈合所需的时间。1.4.2新生上皮宽度灌胃14dfi，测量各组新生上皮的宽度。沿创缘前后及创缘左右各取4点（每点相对于创面中点的连线各成90o）,用游标卡尺测量各点新生上皮的宽度，取平均值。1.4.3形态学观察造模后第8犬创面屮央肉芽组织取材，牛理盐水冲净血污，10%屮性甲醛固定，石蜡包埋，切片厚约5mm,常规HE染色，光学显微镜观察每高倍（10x40）
7、视野下各组肉芽组织毛细血管（完整管腔）、纤维母细胞数及坏死程度，并用计分法表示，计分标准如下。毛细血管：无，计0分；1〜5个，计1分；6〜10个，计2分；>10个，计3分。纤维母细胞：无，计0分；1〜30个，计1分;31〜50个,计2分;>50个，计3分。坏死程度:无坏死，计0分;坏死少，计1分;坏死较多，计2分;坏死多，计3分。1.4.4肉芽组织细胞周期测定造模后第8天创面中央肉芽组织取材，新鲜组织置于生理盐水中，样品处理示制成单细胞悬液，碘化丙噪标记，避光静置30min,流式细胞仪检测，自动拟合出细胞周期各时和比例。1.4.5免
8、疫纟fl化ABC法检测EGF、TGFpl和FN表达标木甲醛固定，石蜡包埠，切片厚约5pm,脱蜡至水，PBS冲洗3次，每次5min,柠檬酸缓冲液微波处理，92〜100oC,10min,PBS冲洗3次,每次5min,每片加1滴第一抗体,3
