菜油甾醇和孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的合成与优化

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1、菜油甾醇和孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的合成与优化DenovosynthesisandoptimizationofcampesterolandpregnenoloneinYarrowialipolytica学科专业：生物化工作者姓名：张羽指导教师：元英进教授天津大学化工学院二零一七年五月独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得天津大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同

2、工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津大学有关保留、使用学位论文的规定。特授权天津大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。（保密的学位论文在解密后适用本授权说明）学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日摘要菜油甾醇和孕烯醇酮是异源合成甾体激素类药物的重要前

3、体及中间体。本文拟在耶氏解脂酵母中引入异源菜油甾醇和孕烯醇酮合成路径，并通过异源蛋白来源筛选、竞争性路径敲除、乙酰CoA来源与分配优化，蛋白截短和重定位等策略，以期在耶氏解脂酵母中实现菜油甾醇和孕烯醇酮的高水平表达。菜油甾醇在耶氏解脂酵母中合成需引入异源关键酶—7脱氢胆固醇还原酶（DHCR7），本研究对6种DHCR7来源进行筛选获得DHCR7最佳来源—斑马鱼（Daniorerio），通过生物信息学分析发现D409E、G408P及L404F（L404M）是影响酶活性的三个关键突变点，其中D409E突变使非洲爪蟾（Xe

4、nopuslaevis）来源DHCR7酶活下降86%。通过敲除麦角固醇路径酶ERG5，并导入斑马鱼（Daniorerio）来源DHCR7，获得仅积累菜油甾醇的高产菌株SyBE_Yl02060056，其摇瓶水平产量是报道最高产量的1.38倍。以该菌株为底盘，在葡萄糖和葵花籽油两种碳源下表征13种乙酰CoA合成与分配相关基因对菜油甾醇的调控作用，得出以葵花籽油为碳源时的3个关键代谢调控靶点HMGR、ACL和POX2，这三个靶点分别使菜油甾醇产量提高1.32、1.22和1.19倍。在5-L发酵罐中进行发酵工艺优化获得菜油

5、甾醇最高产量941.5mg/L，为目前已知最高产量。孕烯醇酮在耶氏解脂酵母菌株中以菜油甾醇为前体经P450scc系统（包括CYP11A1、AdR和AdX）催化合成。对36种不同来源P450scc组合进行筛选，首次实现孕烯醇酮在耶氏解脂酵母中的全合成，并获得最佳组合野猪（Susscrofa）来源CYP11A1及牛（Bostaurus）源AdR和AdX。探究影响孕烯醇酮合成的因素，包括底物特异性、前体菜油甾醇存在形式、前体与酶接触及酶活性等，发现前体与酶空间位置隔离及酶活性不足是导致孕烯醇酮产量较低的关键。通过选用强启

6、动子并将野猪（Susscrofa）来源CYP11A1重定位于脂质体膜上，使孕烯醇酮产量达到3.1±0.5mg/L，提高了13倍。本研究采用多种策略对耶氏解脂酵母中菜油甾醇和孕烯醇酮的合成进行优化，为其他萜烯类物质产量提升提供多种有效优化方式，同时为其他微生物高产萜烯类物质提供借鉴意义。另外本实验获得的菜油甾醇及孕烯醇酮高产菌株可供后续甾体激素类产物的进一步合成。关键词：甾体激素药物，菜油甾醇，孕烯醇酮，合成生物学，耶氏解脂酵母，产量优化IIIABSTRACTCampesterolandpregnenoloneare

7、importantprecursorandintermediatetoheterologoussyntheticsteroiddrugs.ThisstudyplanedtointroduceheterologouscampesterolandpregnenolonesynthesispathwaysinYarrowialipolytica,andcarryoutavarietyofoptimizationstrategies,includingscreeningheterologousproteinsource,k

8、nockingoutcompetitivepathway,optimizingacetyl-CoAsupplementanddistributionandtruncatingorredirectingenzyme,hopingtoachievehigh-levelexpressionofcampesterolandpregnenoloneinYarrowia