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1、大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌整合子分布与ESBLs耐【摘要】目的研究产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因水平转移中的作用。方法采用PCR方法检测产ESBLs和非产ESBLs大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在产TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布及经质粒转移的情况。结果产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32.9%；产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因,blaSHV+CTX基因检出率为12.9%、blaCTX+TEM为9.8%、blaSHV+TEM为8.7%和blaSHV
2、+CTX+TEM为5.2%。结论产ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX和blaSHV基因与整合子具明显相关性；整合子携带着1个以上的多个耐药基因盒,与宿主菌的多重耐药性密切相关。【关键词】耐药基因超广谱β内酰胺酶整合子【Abstract】ObjectiveTostudythedistributionofclassⅠintegroninextended-spectrumbeta-lactamases(ESBLs)-producingEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeanditscontributioninhorizontaltransferof
3、ESBLsgenes.MethodsThepresenceofclassⅠintegronamongESBLs-producersandnon-ESBLs-producersofEscherichiacoliandKlebsiellapneumoniaeerasechainreaction(PCR).Thecorrelationandco-transferbetultidrugresistanceinESBLs-producingstrains.【Keyl)的培养基筛选接合菌,制备模板用于PCR扩增。1.8PCR耐药菌基因［2］根据GenBank公布的Ⅰ类整合子整合酶基因和blaSHV、b
4、laCTX和blaTEM基因序列，采用Primer软件设计引物(表1)。反应体系均为25μl,其中缓冲液2.5μl,10mmol/L4×dNTP0.5μl,50μmol/上下游引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超纯水18.75μl。根据不同引物设立不同PCR反应条件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型阳性对照，以TEM-26型大肠埃希菌作TEM型阳性对照,产物经电泳,在紫外线下观察结果,并在凝胶上成像。1.9DNA序列分析［3］PCR扩增的基因片段经电泳后,切下相应条带纯化,进行DNA测序,结果在GenBank序列数据库进行同源性分析(BLASTN)。1．
5、10统计学处理［2］细菌耐药性分析用WHO5软件进行分析，耐药率差异有显著性，用SPSS10.0统计软件分析,两组耐药率比较应用χ2检。表1用于检测耐药基因的引物2结果与分析2．1ESBLs检出结果及耐药率281株肺炎克雷伯菌和201株大肠埃希菌共检出ESBLs194株，占40.３%,非产ESBLs细菌为288株占59.7%。产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对抗生素的平均耐药率为74.1%,明显较非产ESBLs株平均耐药率47.9%高(P<0.05)。产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌除头孢替坦外，对其他头孢类抗生素的耐药率均在90%以上；对β内酰胺和碳青霉烯类如氨苄西林、
6、氨曲南和哌拉西林的耐药率为100%，仅对美洛培南和亚胺培南二种抗生素未产生耐药；产ESBLs的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌对多种抗生素耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.05)(表2)。表2产ESBLs和非产ESBLs菌对抗生素的耐药率2．2产ESBLs菌株的PCR检测对13株产ESBLs菌株(其中8株大肠埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PCR产物测序，其中blaTEM阳性的扩增产物为TEM-1基因,blaCTX阳性的扩增产物为CTX-M-3基因,而blaSHV阳性的扩增产物则分别为SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR
7、琼脂凝胶电泳如图1～3。图1TEM基因PCR扩增电泳图图2SHV基因PCR扩增电泳图(1：DNA分子量标志,2000bp梯带；2:阴性对照；3～5:临床菌株。)图3CTX基因PCR扩增电泳图2.3blaTEM、blaCTX和blaSHV的基因检测结果产ESBLs菌株的blaTEM、blaCTX和blaSHV基因检出率分别为58.2%、74.7%和32.9%，产ESBLs菌同时具有≥1种的ESBLs基因如blaSHV+CT
