讨论正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组

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1、讨论正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组-->讨论正常儿童口腔中白色念珠菌的分布及基因分组【摘要】　目的研究以白色念珠菌为代表的念珠菌,代写医学论文以及白色念珠菌基因分组在不同年龄段儿童口腔中的分布情况。方法　4组不同年龄儿童和1组成人作为研究对象,粘膜拭子法取样,CHROMagarCandida鉴定培养基分离鉴定,PCR方法一组引物确认白色念珠菌,一组引物基因分组。结果　不同年龄组儿童口腔中念珠菌的检出率有所不同,除健康青年外,白色念珠菌在检出的念珠菌中均占多数。白色念珠菌3种基因分组的分布也存在差异,以A组为主。结论　不同年龄阶段健康儿童口腔中,A组白色念珠菌组占主导地位。【关键词】　

2、白色念珠菌;基因分组;口腔;儿童白色念珠菌(又称白色假丝酵母菌)是口腔正常微生物群的组分之一,也是口腔中重要的条件致病微生物,是包括新生儿“雪口症”在内的许多口腔疾病的致病菌〔1〕。目前关于不同疾病状态下口腔中白色念珠菌的研究比较多,但是对正常状态下口腔中白色念珠菌的分布,了解还比较少。以前的研究表明,白色念珠菌在不同年龄阶段人群的口腔中,可不同程度的检出〔2〕。白色念珠菌与口腔中的其它微生物共同作用,相互粘附,维持口腔中的正常生态平衡。研究表明,白色念珠菌与格登链球菌(Streptococ-cusgordonii)有复杂的相互作用。另外,白色念珠菌与正常的口腔粘膜之间也有复杂的粘附机制,唾液

3、中的富脯蛋白有介导白色念珠菌粘附的作用〔3〕。研究不同年龄阶段人群口腔中白色念珠菌的分布情况,以及对其进行进一步的基因分组,研究不同基因分组白色念珠菌的分布特征,是白色念珠菌分子流行病学研究的重要内容。我们研究了从新生儿到青少年的4个人群,了解了不同年龄阶段儿童口腔中以白色念珠菌为代表的念珠菌群的检出情况,以及白色念珠菌的基因分组情况,为研究白色念珠菌早期定植以及正常演替提供基础。材料和方法研究对象:共有5个研究人群,A1(新生儿组):出生1周以内的健康新生儿打分在9分以上者,共有40名,男孩18名,女孩22名,平均年龄为3d。A2(乳牙列儿童组):40名,平均年龄为3.2岁,男孩21名,女孩

4、19名。A3(混合牙列期儿童组):55名,平均年龄7.2岁,男孩32名,女孩23名。A4(恒牙列儿童组):57名,平均年龄12.7岁,男孩34名,女孩23名,乳牙已经全部换完。A5(健康青年组):40名,平均年龄20.4岁,男性16名,女性24名。纳入标准为无系统性疾病和遗传疾病,没有龋病、明显牙周疾病以及口腔粘膜病。以上人群均来自成都本地或在本地生活1年以上(新生儿除外)。主要实验器材和试剂:鉴定培养基CHROMagarCandida(法国科玛嘉公司);PCR使用试剂,包括Taq聚合酶以及引物的合成(TaKaRa大连宝生物工程公司);小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒(上海华舜生物工程公司);梯

5、度PCR仪GradientThermalCycle(Ep-pendorf公司,德国);Bio-RAD凝胶成像及分析系统(gel-Doc2000美国)。取样及分离鉴定取样方法:使用改良的棉拭子法,在每一名儿童的口腔颊粘膜处反复涂擦5次,将棉拭子头部剪断,放入事先消毒灭菌的装有500μlPBS液的离心管中,在2h以内送到实验室,将其在VERTEX上振荡2min,无菌镊子将拭子头部的液体尽量挤出,将所有的样本调整到300μl,弃去多余液体,6000g离心10min,弃去上清液,用100μl的PBS液重新混悬,准备接种。接种培养和鉴定:取样本15μl接种在CHROMa-garCandida鉴定培养基,

6、37℃恒温细菌培养箱需氧培养48h,根据培养基上菌落的颜色来判断不同的念珠菌种类,绿色菌落是白色念珠菌,紫色菌落是平滑念珠菌,蓝色菌落是热带念珠菌,白色为不能鉴定出来的其它念珠菌〔4〕。为确认白色念珠菌,用PCR的方法作进一步的鉴定。白色念珠菌DNA的提取、鉴定和基因分组:按照小量酵母菌DNA提取纯化试剂盒使用说明要求,将已纯化的单个菌落从培养基中挑出,麦氏比浊法,用灭菌的PBS缓冲液将细菌数目调整到109/ml,使用lyticase酶破细胞壁,蛋白酶K消化蛋白,RNase除去RNA,吸附柱法获得白色念珠菌的DNA。白色念珠菌的鉴定,根据文献〔5〕的方法,使用针对白色念珠菌线粒体DNA上的EO

7、3序列而设计的一对引物,引物1:5′-CACCAACTCGACCAGTAGGC-3′;引物2:5′-CGGGTGGTCTATATTGAGAT-3′。反应条件94℃预变性5min,然后94℃1min,56℃2min30s,72℃3min,30个循环以后72℃延伸7min。反应产物用2%的琼脂糖电泳,100V40min,溴乙锭显色,白色念珠菌的扩增产物是125bp左右。白色念珠菌基因分组,根据Mich