检测老年胃癌患者腹腔灌洗液ck19、cea mr

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1、检测老年胃癌患者腹腔灌洗液CK19、CEAmR【摘要】目的观察细巢式逆RTPCR检测老年胃癌患者腹腔冲洗液瘤细胞胞角蛋白19(CK19)、癌胚抗原(CEA)的临床价值。方法收集45例进展期老年胃癌和8例胃良性病变患者腹腔冲洗液200ml，其中100ml行RTPCR检测CK19、CEA　mRNA，另100ml用于HE染色细胞学检查，胃癌细胞SGC7901为阳性对照。结果45例老年胃癌病人腹腔冲洗液中CK19mRNA的阳性表达率为55.6%(25/45);CEAmRNA的阳性表达率为51.1%(23/45)

2、;CK19、CEAmRNA的联合检测阳性率为62.2%(28/45)。细胞病理学检查45例胃癌病人有8例腹腔冲洗液中发现肿瘤细胞，阳性率为17.8%(8/45)，且此8例CK19、CEAmRNA检测结果均为阳性。CK19、CEAmRNA阳性率与肿瘤胃壁浆膜受侵、淋巴结转移和胃癌分期明显相关(P<0.05)。结论腹腔冲洗液中CK19、CEAmRNA检测胃癌细胞敏感性高。初步临床观察显示此方法对于早期诊断胃癌患者腹腔种植有一定价值。【关键词】胃癌;细胞角蛋白19;癌胚抗原;腹腔冲洗液近年来老年胃癌病人逐渐

3、增多，目前多采用以手术为主的根治术，但发现时多属中晚期故预后仍较差。影响预后的主要因素之一是腹腔转移，腹腔脱落癌细胞(ECC)是腹膜转移之源〔1〕。因此早期检出ECC，及时采取有效的干预措施，是改善胃癌病人预后的关键。由于脱落的游离癌细胞数量少，浓度低，使得传统的细胞学检查(CY)阳性率低，有很高的漏诊率〔2，3〕。细胞角蛋白19(CK19)在胃癌腹腔转移灶中的表达却存在争议。以往巢式RTPCR技术检测CK19、癌胚抗原(CEA)mRNA已成功地运用于胃癌淋巴结、骨髓及血液微转移的研究，国内外少见用于胃癌

4、腹腔微转移的研究，尤其关于老年患者更无报道。本研究采用巢式RTPCR技术检测老年胃癌患者腹腔冲洗液中瘤细胞CK19、癌胚抗原(CEA)mRNA的表达，探讨其对早期诊断腹腔转移的临床实用价值。　　1材料与方法　　1.1检测对象标本于本院2006年9月至2007年2月接受手术的45例老年胃癌病人，均经手术及病理证实。其中男性29例，女性16例，年龄60～76岁，中位年龄66岁。临床病理学特征：45例中大体浆膜受侵18例，病理累及浆膜31例，组织学类型高中分化28例、低分化17例，淋巴结有转移26例、无转移19

5、例，病理分期Ⅰ+Ⅱ期21例、Ⅲ+Ⅳ期24例。　　1.2方法　　1.2.1标本制备开腹探查腹腔后，于Douglas窝或左膈下置入一根16号导尿管，注入200ml无菌生理盐水，在不触动原发灶的情况下，轻轻搅动后吸出，如有自然腹水则直接吸出。所有标本均分成两部分，一部分送本院病理室行细胞学检查。2500r/min离心10min，弃上清液，沉渣涂片，HE染色后镜检。另一部分立即于4℃下2500r/min离心10min，弃上清液，置-80℃冰箱备用。　　1.2.2mRNA提取采用mRNA抽提试剂盒(B.M公司)提取腹

6、腔冲洗液离心沉渣mRNA，采用PrimeScriptTMRTase,2StepRTPCR试剂盒(宝生物工程有限公司)行逆转录。操作步骤按照试剂盒说明书进行。　　1.2.3巢式PCR扩增CK19、CEA产物宝生物工程(大连)有限公司合成引物序列。CK19mRNA巢式PCR引物〔4〕：A,5′AAGCTAACCATGCAGAACCTCAACGACCGC3′;B,5′TTATTGGCAGGTCAGGAGAAGAGCC3′;C,5′TCCCGCGACTACAGCCACTACTACACGACC3′;D,

7、5′CGCGACTTGATGTCCATGAGCCGCTGGTAC3′。CEAmRNA巢式PCR引物〔5〕：E,5′TCTGGAACTTCTCCTGGTCTCTCAGCTGG3′;F,5′TGTAGCTGTTGCAAATGCTTTAAGGAAGAAGC3′;G,5′GGGCCACTGTCGGCATCATGATTGG3′。内对照βactin引物序列〔6〕：上游引物：5′CACTGTGTTGGCGTACAGGT3′;下游引物：5′TCATCACCATTGGCAATGAG3′。PCR按说明

8、书反应分两步，第一步模板为反转录的产物cDNA，CK19mRNA的引物为A、B,CEAmRNA的引物为E、F。反应条件：94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环。第二步取第一步扩增产物2μl，CK19mRNA的引物为C、D，CEAmRNA的引物为F、G，以同样步骤扩增30个循环。　　1.2.4阴、阳性对照设置以胃癌细胞SGC7901相应mRNA为阳性对照，阴性对照组采用空白对照，即除不加模