人巨细胞病毒感染后平滑肌细胞即刻早基因及晚期基因

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1、人巨细胞病毒感染后平滑肌细胞即刻早基因及晚期基因【摘要】目的通过检测体外培养平滑肌细胞(SMCs)感染人类巨细胞病毒(HCMV)后即刻早期(IE)基因及晚期(L)基因的表达与调控,探讨HCMV感染致动脉粥样硬化(AS)的可能机制。方法应用PCR方法，在SMCs感染HCMV后不同时相点，检测IE基因、L基因的DNA，同时应用反义寡核苷酸及丙氧鸟苷作用于感染细胞，动态观测其对IE基因、L基因的抑制作用。结　　果感染细胞12h即可检测到IE基因，24h可同时检测到IE基因和L基因，48和72h只能检测到L基因。丙氧鸟苷作用后，IE基因和L基因相对减弱。而反义硫代寡核苷酸(ASO

2、N)作用后，IE基因明显受到抑制，L基因减弱明显。结论SMCs感染后IE基因、L基因的表达与调控可能在HCMV致AS的发病机制及其治疗中具有重要意义。【关键词】平滑肌细胞;巨细胞病毒;IE基因;L基因;动脉粥样硬化　人巨细胞病毒(HCMV)抗原及其DNA序列存在于动脉粥样硬化(AS)的病灶组织，主要见于血管平滑肌细胞(SMCs)和血管内皮细胞(EC)〔1〕，表明HCMV感染可能促使了AS发生和发展〔2，3〕，但其致病机制尚不清楚。已知HCMV基因在受染细胞内表达有一定时序性,按其先后顺序分为即刻早期(IE)、早期(E)和晚期(L)三种,其中，IE及L基因的检出分别反映HC

3、MV转录、翻译、复制的不同生物学阶段及其与感染细胞相互作用的生物特征，因此，本研究对HCMV感染SMCs后IE及L基因表达与调控进行了初步研究，旨在探讨HCMV感染导致AS的分子机制。　　1材料与方法　　1.1病毒增殖HCMV-AD169毒株由解放军总医院实验技术中心提供。将HCMV-AD169标准毒株接种于已经融合单层的的人胚肺细胞进行增殖，增殖到一定滴度后转染SMCs。　　1.2SMCs的培养与鉴定按文献方法〔4〕进行，RPMI-1640培养基(Hyclone,Sh30011.01),胎牛血清(Hyclone，SH30088.02)，胰蛋白酶(Sigma)鼠抗人肌动蛋

4、白单克隆抗体(北京中山公司，克隆系：HHF35，ZM0005)。　　1.3反义硫代寡核苷酸与丙氧鸟苷全硫代修饰的ASON由申友公司设计与合成。福米韦生(ISIS2922)5′-GsCsGsTsTsTsGsCsTsCsTsTsCsTsTsCsTsTsGsCsGs-3′，作用剂量为8.0μmol/L。丙氧鸟苷：湖北科益药业，使用剂量为1.8mg/L。　　1.4病毒滴度测定及接种50%组织细胞感染量(TCID50)的测定：病毒接种，将100TCID50的HCMV-AD169株病毒加入到含10%小牛血清的RPMI-1640细胞维持液中，每孔0.5ml接种于细胞单层上，37℃吸附2

5、h，用细胞维持液洗涤单层细胞两次，再补充细胞维持液。37℃5%CO2培养箱中培养。病毒抗原表达：采用间接免疫荧光法。　　1.5实验分组实验共分4组：感染组;细胞对照组;ASON作用组(用100TCID50的HCMV-AD169感染，37℃1h后用PBS洗涤，再加入8.0μmol/L的ASON);丙氧鸟苷作用组(用100TCID50的HCMV-AD169感染，37℃1h后用PBS洗涤，再加入1.8mg/L的丙氧鸟苷)。　　1.6感染细胞IE基因、L基因检测采用PCR方法感染后12、24、48、72h收获细胞。PCR扩增与检测反应体系：模板DNA2μl,dNTPs4μl,10

6、×PCR缓冲液5μl,MgCl2(2.5mmol/L)2μl,TaqDNA聚合酶2μl。循环条件：94℃1min;55℃1min;72℃1.5min;共循环35次。取反应产物10μl点样于1.5%琼脂糖凝胶上,80V电泳40min,在激光密度扫描仪上扫描分析,以AD169的扩增条带与内参照条带扫描峰面积比，表示IE/L-DNA水平。各引物见表1。表1IE、L基因PCR引物序列　　1.7统计学处理应用origan软件，数据资料以x±s表示，两组均值比较用t检验，各组率的比较用χ2检验。　　2结果　　2.1SMCs的培养与鉴定SMCs在倒置显微镜下外观呈长梭形，细胞生长致密时

7、排列成束，相互平行，并且重叠生长，表现为典型的“波峰”与“浪谷”状，免疫组化法进行SMCs肌动蛋白染色，显微镜下可见细胞质内着棕黑色颗粒。　　2.2病毒抗原染色免疫荧光法检测受染细胞中的病毒抗原，在细胞胞质内可见特异性颗粒状或片状分布的荧光颗粒。　　2.3感染细胞IE、L基因检测结果感染细胞12h即可检测到IE基因，24h可同时检测到IE和L基因，48和72h只能检测到L基因。丙氧鸟苷作用后，IE和L基因相对减弱。而ASON作用后，IE基因明显受到抑制。L基因减弱明显。见图1，表2。　图1SMCs感染HCMV后及丙氧鸟苷、AS