2.3分解纤维素的微生物的分离

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1、课题3分解纤维素的微生物的分离一、基础知识（一）纤维素和纤维素酶1．纤维素是一种由葡萄糖相连而成的高分子多糖类化合物。2．棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物。纤维素在纤维素酶的催化作用下分解。过程如下：【拓宽视野】纤维素与纤维素酶纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是由葡萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可

2、以分解纤维素的微生物。微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。3．纤维素酶水解滤纸实验：添加纤维素酶的试管中，滤纸被分解，不添加纤维素酶的试管中，纤维素没有被分解。通过该实验，证明了纤维素酶对纤维素的分解作用。4．1个酶活力单位（1U）是指在温度为25℃，其它反应条件最适宜情况下，在1min内转化1mmol的底物

3、所需要的酶量。（二）纤维素分解菌的筛选1．筛选纤维素分解菌的方法是刚果红染色法。该方法可以通过颜色反应直接筛选。2．其原理是：刚果红与纤维素形成红色复合物，当纤维素被纤维素酶分解后，红色复合物无法形成，出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，我们可以通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。二、实验设计（一）实验方案流程图：【思考1】实验流程中“选择培养”使用的是什么类型的培养基？该培养的目的是什么？答：使用的是纤维素分解菌液体选择培养基。其目的是使纤维素分解菌增殖，含量增多。【思考2】本实验流程与尿素分解菌的分离实验流程有哪些异同？答：尿素分解菌的分离实验流程是将土

4、样制成的菌悬液直接涂布在选择培养基上；本课题通过选择培养使细菌增殖后，再涂布在鉴别培养基上。其它操作基本相同。（二）实验的具体操作步骤：1．土样采集土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。【思考3】为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？答：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用，只有在纤维素含量丰富的环境中纤维素分解菌的含量才会高于其它普通环境，从而提高获得目的微生物的几率。【思考4】将滤纸埋在土壤中

5、有什么作用？滤纸应该埋进土壤多深？答：人工设置适宜环境，使纤维素分解菌相对聚集。一般将纸埋于深约10cm的腐殖土壤中。2．选择培养纤维素分解菌的选择培养基配方纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4,7H2O1.2gKH2PO40.9gMgSO4.7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL【思考6】纤维素分解菌选择培养基的选择作用机制是什么？答：以纤维素粉为唯一碳源，只有分解纤维素分解菌才能生存。【思考7】若设置对照实验说明选择培养的作用，应如何设置？答：将控制的变量由纤维素粉改为葡萄糖，其他相同。

6、3．刚果红染色法分离鉴别纤维素分解菌的培养基配方CMC-Na5～10g酵母膏1gKH2PO40.25g琼脂15g土豆汁100mL上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1000mL【思考9】纤维素分解菌选择培养基和纤维素分解菌鉴别培养基按物理性质各属于什么培养基？答：前者属于液体培养基，后者属于固体培养基。常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。【思考9】请填表比较两种染色法的各自的优缺点：染色法优点缺点方法一颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用操作繁琐，刚果红会使菌落之间发生混杂方法二操作简便，不存在菌落

7、混杂问题产生淀粉酶的微生物也产生模糊透明圈，有些微生物能降解色素，形成明显的透明圈。三、操作提示（一）在该实验中，涉及到多种微生物技术，包括培养基配制技术、无菌操作技术、稀释涂布法、选择培养基的选择培养技术、土壤取样等。（二）选择培养的操作方法称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL经过灭菌处理的选择培养基的摇瓶中，将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。吸取5mL培养液，转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。吸取0.1mL培养液进行梯度稀释，然后涂布在鉴别纤维素分解菌的培养基上。【思考10】为什么选择培养

8、能够“浓缩”所需的微生物？答：在选择培养的条件下，可