选择性环氧合酶2抑制剂ns398对肝星状细胞

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1、选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞【摘要】目的:观察选择性环氧合酶2抑制剂NS398对肝星状细胞（HSC）凋亡及凋亡相关基因的影响。方法:采用不同浓度的NS398作用于HSCT6,应用流式细胞术和透射电镜检测HSC凋亡,细胞免疫化学法检测凋亡HSC中凋亡相关基因p53、bcl2蛋白表达的变化。结果:90、120、150μmol/LNS398作用HSCT648h后,流式细胞术检测到HSC凋亡,各组凋亡指数分别为（10.5±0.015）%、（13.2±0.010）%和（17.3±0.012）%,与对照组(4.3±0.006)%比

2、较,差异有统计学意义（P<0.01）;透射电镜观察到细胞皱缩、核染色质浓缩沿核膜排列等细胞凋亡特征性改变;以120μmol/LNS398作用HSCT648h后,凋亡相关蛋白p53、bcl2的阳性细胞百分率分别为（82.06±0.14）%、（34.20±0.77）%,与对照组（14.06±0.24）%、（96.66±0.79）%比较,差异有统计学意义（P<0.01）。结论:NS398可以剂量依赖性诱导HSC凋亡;上调凋亡相关基因p53的表达,下调bcl2的表达可能是NS398诱导HSC凋亡的机制之一。【关键词】环氧合酶2NS3

3、98肝星状细胞细胞凋亡　　肝星状细胞(hepaticstellatecell,HSC)在肝纤维化的发生发展中具有重要作用,HSC增殖与凋亡的失平衡是肝纤维化发生发展的主要细胞生物学基础,在肝纤维化的发生发展中起重要作用,诱导其凋亡是治疗肝纤维化的重要策略。有观察显示HSC中有选择性环氧合酶2（cyclooxgenase2,COX2）基因的表达,而且其表达与HSC的增殖有关［1］。我们前期的研究已证实选择性环氧合酶2抑制剂NS398可以确切地抑制HSC增殖［2］。本实验拟进一步观察NS398诱导HSC凋亡的作用及其可能的分子机制,以探索临床抗

4、肝纤维化的新途径。　　1材料和方法　　1.1材料肝星状细胞系（HSCT6）,由上海中医药大学徐列明教授提供,系SV40转染的大鼠HSC,具有活化HSC的表型;NS398为美国Cayman公司产品;DMEM培养液、新生牛血清分别购自美国Gibco及Hyclone公司;AnnexinⅤFITC及PI购自美国罗氏公司;小鼠抗大鼠bcl2单克隆抗体(mAb)购自美国SantaCruz公司;兔抗大鼠野生型p53多克隆抗体购自武汉博士德公司;即用型第2代免疫组化EliVisionplus广谱试剂盒和DAB显色试剂盒购自福建迈新生物技术有限公司。　　1.2方

5、法　　1.2.1NS398贮存液的配制以少量DMSO溶解,加入无血清DMEM配制成800μmol/L的贮存液,0.22μm微孔滤器过滤除菌,分装,避光存于-20℃保存,2周内有效。使用时用含20mL/L血清的DMEM培养液稀释至所需的药物浓度,DMSO的终浓度要求低于1‰,细胞对照组加入相同浓度的DMSO,以排除DMSO对细胞生长的影响。　　1.2.2HSCT6的培养与传代采用含100U/mL青霉素、100U/mL链霉素、100mL/L新生牛血清的DMEM培养液,在37℃、50mL/LCO2及饱和湿度下培养,隔日换培养液,待细胞生长至80%～90%

6、密度时,用0.2g/LEDTA和2.5g/L胰蛋白酶消化,按1∶4比例传代。　　1.2.3药物细胞毒性试验倒置显微镜下观察HSCT6形态。NS398对HSCT6的细胞毒性:取对数生长期细胞,调整细胞密度为7.5×107/L,细胞接种于96孔培养板中,每孔200μL,24h后弃上清,加入含不同浓度的NS398（0、5、20、40、80、120、160、240、320μmol/L）培养液,每孔200μL,每组设4个复孔,培养48h后,收集培养液上清,全自动生化分析仪检测上清中LDH水平。　　1.2.4细胞凋亡检测流式细胞术检测:取对数生长期细胞,以

7、1.2×106/瓶的密度接种于T25培养瓶中,24h后加入各浓度NS398（0、90、120、150μmol/L）培养48h,收集所有细胞,取1×106洗涤细胞,加100μL结合缓冲液,并加AnnexinVFITC染液和碘化丙啶（PI）染液各2μL,室温避光染色30min,再加结合缓冲液300μL,以流式细胞术检测HSC凋亡,AnnexinVFITC+/PI-为凋亡细胞,计算各组细胞的凋亡百分率。细胞凋亡的形态学观察:取对数生长期细胞,以1.2×106/瓶的密度接种于T25培养瓶中,24h后选取凋亡率较高的150μmol/LNS398作为实

8、验浓度作用48h,收集悬浮与贴壁的细胞,PBS洗涤1次,25g/L戊二醛4℃固定1h,10g/