非洛地平对oxldl损伤的人脐静脉内皮细胞一氧

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1、非洛地平对oxLDL损伤的人脐静脉内皮细胞一氧【摘要】目的探讨非洛地平对氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)损伤的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA及一氧化氮(NO)表达的影响。方法将原代细胞分为空白对照组、oxLDL(6、12.5、25mg/L)损伤组、非洛地平(0.1、1.0、10μmol/L)+oxLDL(25mg/L)干预组，采用实时荧光定量PCR技术检测eNOS、iNOS的mRNA水平，硝酸还原酶法测定培养上清中NO的浓度。结果oxLDL损伤内皮细胞后，eNO

2、S、iNOSmRNA及NO较空白对照组升高;非洛地平下调oxLDL损伤的内皮细胞iNOS的表达，增加其NO的生成。结论非洛地平可抑制低浓度oxLDL诱导的iNOSmRNA表达，增加NO的生成，发挥其保护内皮细胞的功能。【关键词】非洛地平;一氧化氮合酶;一氧化氮;动脉粥样硬化ABSTRACT:ObjectiveToinvestigatetheprotectiveeffectsoffelodipineonmRNAlevelsofendothelialnitricoxidesynthase(eNOS)andinduciblenitricoxi

3、desynthase(iNOS)asonoxidum(NO)fromhumanumbilicalveinendothelialcells(HUVECs)injuryedbyoxidizedlog/L),andinterventiongroupoffelodipine(0.1,1.0and10μmol/L)+oxLDL(25mg/L).TheneNOSandiNOSexpressionseasuredbyrealtimepolymerasechainreactionandthelevelofNOinthesupernatantsofthe

4、culturesethod.ResultsThemRNAexpressionsofeNOSandiNOSinHUVECsandNOlevelinthesupernatantsduringtreatmentechanismmayberelatedtoitsloRNAexpressionofiNOSinducedbyloonoxidum;atherosclerosis　　动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是严重危害人类健康的疾病，氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)在As的发生、发展中起着重要作用。内源性一氧化氮(NO)主要是由

5、血管内皮细胞在一氧化氮合酶(NOS)的作用下产生的，内皮受损后，NO的合成、释放功能障碍导致内皮依赖性的舒血管反应降低，促进As的形成[1]，其机制涉及NOS的基因调控和活性调节[2]。NOS可分为内皮型(eNOS)和诱生型(iNOS)，eNOS在正常条件下存在于血管内皮细胞中，保证NO的基础释放;生理条件下iNOS蛋白无活性表达，病理状态下产生大量NO引起细胞毒作用，故又称为病理型NOS。近年来，钙通道阻滞剂独立于降压以外的多效作用备受关注，其中抗As作用尤其受到重视。非洛地平(felodipine)是长效二氢吡啶类钙通道阻滞剂，已作为高

6、血压病的首选药物在临床广泛应用。我们前期的研究发现，非洛地平可减轻高脂饮食喂养的兔主动脉粥样硬化病变。本研究试从细胞水平及NOSNO角度进一步探讨其内皮保护作用，为临床应用提供实验依据。　　1材料与方法　　1.1标本本实验选用原代人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcells,HUVEC)，标本来自于西安交通大学医学院第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带放入无菌容器中，3h内行脐静脉内皮细胞的分离培养;置于50mL/LCO2、37℃培养箱中孵育，待原代培养细胞生长至8

7、0%～90%融合后进行传代培养;将原代和传至第3代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，进行Ⅷ因子相关抗原的检测;第4代细胞用于实验。　　1.2oxLDL的制备采用一次性密度梯度超速离心法分离LDL。血浆在密度梯度液中，于4℃、50000r/min离心5h;分离出的LDL在4℃的LDL透析液中透析36h，在无EDTA的PBS中4℃透析36h;加入含CuSO4的PBS液，37℃氧化18h，并于4℃避光保存，备用。采用琼脂糖凝胶电泳法鉴定LDL和oxLDL的纯度，并用硫代巴比妥酸反应法确定其氧化修饰程度。　　1.3主要试剂M199培养基购自GIBC

8、O公司;胎牛血清购自杭州四季青生物研究所;非洛地平原粉、溶剂二甲亚砜(DMSO)购自Sigma公司;总RNA提取试剂Trizol购自Invitrogen公司;逆转录聚合酶链反应