副溶血弧菌转录因子apha调控生物膜基因的初步研究

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1、副溶血弧菌转录因子AphA调控生物膜基因的初步研究第1章文献综述1.1副溶血弧菌生物学特性留溶血弧菌parahaemolyticus,简称VP菌）属于弧菌科弧菌属。该属成员广泛存在于海水、海产品及海河交界处，亦可见于动物与人的消化道。目前确认的有30多种，霍乱弧菌、创伤弧菌、哈氏弧菌等均为该属成员⑴。它是我国沿海地区最常见的食物中毒病原菌。色革兰氏阴性嗜盐不产孢子菌，随培养基不同菌体形态差异较大，有卵圆形、梨形、棒状，弧形等多种形态，两极浓染。无芽孢，无荚膜，含有侧鞭毛和車个极鞭毛，能在液体介质及固体表面上运动(图1.1A)。VP菌为

2、一嗜盐性细菌，在普通培养基中加入适量NaCl即能生长，其在0.5%-10%NaCl浓度下均可生长，尤以含盐量在2%-4%条件下生长状态最佳。本菌不耐酸，不耐热，不耐冷，对常用消毒剂抵抗力弱。在15?44°C范围内均可生长，以35?37°C条件下为最佳状态，当温度低于4°C时则停止生长II；最适pH生长范围为7.5-8.5，以PH7.7-8.0为最佳在2%?4%NaCl浓度的琼脂平板上呈蔓延生长，菌落边缘不整齐、凸起、湿润、光滑、不透明。在VP菌专用选择培养基硫代硫酸梓檬胆盐庶糖琼脂糖（TCBS)平板上形成l-2

3、.5nim，稍隆起、无粘性、浑池、蓝绿色菌落（图1.1B)。在SS平板上不生长或长出l-2mm无色、扁平、半透明菌落，不揚挑起，挑起时呈粘丝状。在羊血琼脂平板上形成2-3mm圆形、湿润、隆起、灰白色菌落，某些菌株可形成a溶血或P溶血D2210633为03:K6血清型临床分离菌株，TDH和KP均为阳性。生物膜是微生物群落由特定细胞外基质包裹而形成的表面结构，是许多微生物适应不利环境并传播而采取的主要生存策略弧菌形成生物膜使其具有高感染性（Hyperinfectivity)，促使发挥粘附、溶血活性、细胞毒性及肠毒性等，危害性严重从而成为近

4、年研究热点。c-di-GMP合成和胞外多糖合成等能促进VP菌生物膜的形成，从而使副溶血弧菌具有高感染力。目前研究已表明在VP菌中OpaR调控子通过抑制毒力基因的表达和在固相表面的爬动能力[_，从而促进荚膜多糖（EPS)的合成在固相表面的爬动是生物膜形成的起始步骤，而CPS是生物膜基质的主要成份之一。AphA和OpaR同为VP菌核心转录因子，研究表明其分别在低密度和高密度下发挥作用。根据OpaR能在高密度下调节鞭毛基因的表达，以及已有报道的创伤弧菌、霍乱弧菌和费氏弧菌鞭毛介导的运动影响生物膜的形成等，提出VP菌的AphA转录因子作为VP

5、菌QS系统的核心调控子是否与霍乱弧菌和哈氏弧菌的QS核心调控子一样也参与调控生物膜的形成，这是本研究需要探讨的问题，从而通过研究来控制VP菌生物膜的形成，为由VP菌引起的疾病的预防和治疗提供基础。因此本研究目的在于综合运用表型与分子生化实验来探究副溶血弧菌的转录因子AphA对VP菌生物膜形成的调节机制。..................第3章AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜表型........173.1概述........143.2方法........183.3结果........203.3.1AphA蛋白影响VP菌生物膜表型....

6、....203.3.2AphA促进c-di-GMP的合成........213.4讨论........223.5本章小结........23第4章副溶血弧菌AphA蛋白的DNA结合活性分析........254.1材料........254.2方法........314.3AphA蛋白的表达.......394.4讨论........444.5本章小结........44第5章副溶血弧菌LacZ报告基因融合实验及实时定量RT-PCR........475.1材料........485.2方法........485.3结果.......

7、.565.4讨论........585.4本章小结........59第5章副溶血弧菌LacZ报告基因融合实验及实时定量RT-PCR原核基因表达的启动子区，包含有RNA聚合酶识别位置-35、-10序列及上游元件共同组成的核心启动区，还有转录因子结合的区域。如图5.1所示，把启动子核心元件和转录因子结合位点一同分子克隆入载体质粒pHRn09中的酶切位点和Kpnl之间，由于在酶切位点下游连接着p-半乳糖苷酶LacZ报告基因，因此在PHRP309重组质粒中就包含一段DNA序列，这段序列由p-半乳糖苷酶编码区及祀基因启动子区构成。再把这个重组

8、质粒分别电穿孔转入副溶血弧菌的野生株（P的合成和生物膜的形成，使其具有高感染性。2.本课题首先利用大肠杆菌BL2iaDE3)表达系统，成功表达出了VP的AphA蛋白（位于胞楽区的第1-179个氨基酸，即His-AphA)