dpph法测定沙棘籽原花青素清除自由基的能力

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1、DPPH法测定沙棘籽原花青素清除自由基的能力【关键词】沙棘籽原花青素DPPH沙棘是胡颓子科，多年落叶乔木或灌木，能防风固沙、保持水分、改良土壤，具有优异的生态效益［1］。主产于我国内蒙、宁夏、青海等地，不仅是西部生态治理的优选植物，而且具有很高的药用价值，被誉为“高原圣果”。近年来国内外根据沙棘果实的传统用药，将鲜果开发出沙棘果汁、沙棘口服液、沙棘油等产品，但是作为沙棘果实加工业副产品的沙棘籽，还没有被有效的开发利用。国内外研究表明不同沙棘籽提取物具有抗氧化作用，沙棘籽总黄酮有直接捕获超氧自由基和羟自由基，清除大鼠体内自由基的作用［2-3

2、］。而沙棘籽还富含原花青素［4］，原花青素(Proanthocyanidins)是由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成的黄烷-3-醇衍生物的总称。目前对沙棘籽原花青素清除自由基的作用研究未见相关报道，为此本文对沙棘籽原花青素进行体外抗氧化作用的研究。　　1材料与方法　　1.1实验材料UV-2550紫外分光光度计(日本岛津)，FA公司)，抗坏血酸(分析纯，广州化学试剂厂，批号20061108-1)，儿茶素标准品(中国药品生物制品检定所)，其余试剂均为分析纯。沙棘籽采自宁夏六盘山，经隆德县林业局鉴定为中国沙棘亚种(H.rhamnoidesL.

3、subsp.sinensisRousi)。　　1.2实验方法　　1.2.1DPPH法测定原花青素抗氧化、清除自由基的原理　　二苯基苦味肼基自由基［DPPH·］是一种稳定的以氮为中心的自由基，在517nm波长处有最大吸收。［DPPH·］乙醇溶液呈紫色，其浓度与吸光度呈线性关系。在［DPPH·］乙醇溶液中加入原花青素后，原花青素可以与［DPPH·］结合或发生替代，使［DPPH·］数量减少，溶液颜色变浅，表现为：其在517nm波长处的吸光度不断减小，直至达到稳定。因此，可以通过在517nm波长处检测原花青素对［DPPH·］自由基的清除效果，计算

4、其抗氧化能力。　　1.2.2DPPH标准曲线的制作　　精密称定DPPH标准品9.06mg，乙醇定容至100mL，配制成质量浓度为90.6μg/mL的标准溶液，置4℃冰箱中保存备用。分别吸取1、1.5、2.5、5、10mL标准溶液，乙醇定容至10mL，517nm测其吸光度，以浓度C为横坐标，以吸光度A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为A=0.0149C+0.0062，R2=0.9994　　1.2.3沙棘籽提取物的制备　　将干燥的沙棘籽用高速粉碎机粉碎处理，过100目筛，称取适量，石油醚浸泡脱脂，晾干，85%丙酮提取，料液比为1∶4(m/v

5、)，温度为30℃，回流提取14h后，冷却，抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩，得沙棘籽提取物干粉。　　1.2.4沙棘籽提取物中原花青素含量的测定［6］　　取一定量沙棘籽提取物干粉，配制成0.287mg/mL沙棘籽提取物甲醇溶液，取1mL(另取1mL甲醇液为空白液)，加入显色剂，30℃恒温水浴30min，500nm测其吸光度，根据儿茶素标准曲线测得沙棘籽提取物中原花青素的含量为76.52%。　　1.2.5自由基清除率测定实验［7］　　精密称定0.0501g沙棘籽提取物，乙醇定容至100mL。分别配制浓度为0.0313、0.0625、0.125、0.

6、250、0.501mg/mL乙醇溶液，作为实验组。同时配制等浓度梯度的抗坏血酸作为对照组。采用动力学监测法［8］，测定溶液随时间变化的吸光度A，每30s取值1次，待吸光度基本不变时，药物与自由基反应完全，记录最终吸光度。　　自由基清除率(%)=1-Ai-AjAo×100　　式中：Ａ0为未加药DPPH溶液的空白吸光度；Ａi为加药后DPPH溶液的吸光度；Ａj为样品溶液自身的吸光度。　　1.2.6清除自由基的半数有效量(EC50)的计算和自由基清除能力(AE)的评价　　根据沙棘籽原花青素清除DPPH自由基的曲线，计算得到DPPH自由基原始质量浓

7、度减少至50%(稳定态)时沙棘籽原花青素的用量为半数有效量(EC50)。自由基清除能力(AE)，AE=1/EC50，根据AE的大小判断抗氧化剂清除自由基的能力的大小。　　2结果　　2.1沙棘籽提取物吸光度-时间曲线及其自由基清除率　　图1沙棘籽提取物清除自由基的动力学监测图（略）　　自由基溶液中加入各浓度沙棘籽提取物溶液0.5h(1800s)后，溶液的吸光度不再改变，反应完全(图1)。记录0.5h时的测定值Ai和Aj(表1)。　　表1沙棘籽提取物对自由基的清除率（略）　　2.2抗坏血酸吸光度-时间曲线及其自由基清除率(%)　　图2抗坏血酸

8、清除自由基的动力学监测图（略）　　自由基溶液中加入各浓度抗坏血酸溶液0.5h(1800s)后，溶液的吸光度不再改变，反应完全(图2)。反应时间与样品组保持一致，同样记录0.5h时的测定值Ai和