p53基因在翼状胬肉组织中表达的研究

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1、P53基因在翼状胬肉组织中表达的研究作者：何文林，王利华，陈容森，高阳【摘要】目的通过观察P53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系。方法选择25例翼状胬肉组织作为实验组，对照组选用正常眼侧结膜组织，制作石蜡切片后常规HE染色和p53单克隆抗体免疫组化染色，实验数据进行秩和检验。结果实验组中的P53蛋白含量显著高于对照组，两者差异有高度显著性(P【关键词】翼状胬肉基因p53免疫组织化学翼状胬肉是一种临床上常见的眼表疾病，它以结膜下纤维血管组织呈三角形增生并向角膜侵犯为特征，多见于侧睑裂区，常双眼发病，术后易复发。发展到一定程度可引起散光、视力下降、眼

2、部不适感及美容问题，影响患者的身心健康［1］。关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确，目前认为日光中的紫外线是最重要的环境致病因素在紫外线氧化应激引起的DNA损伤中，p53基因是最常见的被损伤的基因之一［2］。本研究通过观察p53基因在翼状胬肉组织中的表达，探讨翼状胬肉的发病与凋亡机制之间的关系，为明确翼状胬肉的病因和发病机制奠定基础。1资料与方法一般资料25例翼状胬肉组织标本(实验组)随机取自中山市南朗医院眼科病人，均为原发性翼状胬肉患者，胬肉位于鼻侧。其中男10例，女15例，年龄为47〜76岁，平均岁。5例对照组为正常眼鼻侧结膜组织，年龄为51〜62岁，平均岁所有病例均无其他角

3、膜、结膜疾病。各组在年龄、性别、病程方面经统计学处理差异无显著性(P>)，具有可比性。选取胬肉头颈部组织，包括表面结膜样组织，对照组选自正常眼鼻侧结膜组织，距角膜缘约1〜2mm，组织大小约3〜4mm。取材后即置入10%的甲醛溶液浸泡固定，常规脱水、石蜡包埋。石蜡切片的制作从10%甲醛溶液中取出组织，流水冲洗过夜，依次采用乙醇梯度脱水，70%乙醇15s,80%、90%、95%、100%乙醇各3h，二甲苯透明3次，每次lOmin,从低熔点石蜡到高熔点石蜡浸蜡，共3次，每次lh。包埋，4um连续切片，每个石蜡块切4〜5张。HE染色将组织切片依次放入二甲苯脱蜡和95%乙醇各2次，每次lm

4、in;蒸馏水冲洗2次，每次5min;苏木精染色液浸染lOmin；流水冲洗5min；%伊红乙醇浸染2min:95%乙醇和无水乙醇脱水各2次，每次2min；滴中性树脂，加盖玻片光镜下观察翼状胬肉组织的病理学改变。免疫组化染色切片脱蜡至水化，橼酸微波抗原修复15min，3%H202室温孵育lOmin,以消除内源性过氧化物酶活性。PBS浸泡3X5min,加入即用型鼠抗人p53单克隆抗体，4°C过夜，PBS冲洗3X5min,滴加生物素标记的二抗，室温孵育30min,PBS冲洗3X5min,每张切片滴加约5Oul抗生物素-过氧化酶溶液，室温30min。PBS冲洗3X3min。滴加新鲜配制的D

5、AB溶液显色3〜lOmin。用自来水冲洗，苏木素复染，中性树胶封固。以PBS替代一抗作为阴性对照。阳性对照片由福州迈新公司提供。结果判断标准以细胞浆内出现棕色或棕黄色颗粒为阳性染色，每张切片在高倍显微镜下(200倍)随机选择5个视野，计算每个视野阳性细胞率，取平均值作为该标本的阳性细胞率。根据阳性细胞数占上皮细胞的比例判断结果：0〜5%为阴性(-)，5%〜25%为弱阳性(+)，25%〜50%为中等阳性(++)，>50%为强阳性(+++)。统计学处理采用SPSS软件，将实验组与对照组的实验数据进行秩和检脸。2结果HE染色正常结膜的组织学表现结膜分为上皮层和基质层。上皮层由3〜5层细

6、胞组成表层为扁平细胞，中层为多边形细胞，基底层为立方形或柱形细胞。基质层为疏松结缔组织，其间有散在的毛细血管，少量成纤维细胞、淋巴细胞和中性粒细胞。翼状胬肉组织的病理学表现胬肉组织上皮层均可见不同程度的增生。上皮下组织可见成纤维细胞增生活跃、新生血管增多，在血管周围有大量炎性细胞浸润，有淋巴细胞、浆细胞和少量的中性粒细胞。免疫组化染色在翼状胬肉中，P53蛋白染色阳性细胞主要位于上皮细胞基底层。P53基因蛋白产物阳性反应呈棕黄色颗粒，在细胞核呈阳性表达。P53蛋白在两组中的表达见表1，翼状胬肉中的P53蛋白含量较正常结膜高，两者差异具有高度显著性（P3讨论翼状胬肉是一种组织增生性疾

7、病，以新生的纤维血管组织自球结膜生长向角膜表面侵袭为其特点。目前，关于翼状胬肉的病因和发病机制仍未明确。翼状胬肉的临床表现为新生的组织不断生长、增厚，并逐渐侵入角膜，手术切除后易复发，治疗效果不甚理想［3］。此特点与肿瘤组织相似，肿瘤发生发展的重要原因是细胞异常增殖和凋亡失衡。翼状胬肉的发病可能代表着细胞增生和凋亡的异常。目前，已发现的凋亡相关基因多达数十种，根据其功能的不同可分为三类：抑制凋亡基因，如Bel-2、EIB等；促进凋亡基因，如p53、Bax、Fas等，双向调控基因；