大鼠延髓背角和脊髓背角内pkcγ阳性神经元向中缝隐核的投射

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1、大鼠延髓背角和脊髓背角内PKCγ阳性神经元向中缝隐核的投射【关键词】蛋白激酶C中缝隐核延髓背角脊髓背角荧光免疫测定大鼠［ABSTRACT］ObjectiveToinvestigatetheprojectionsofproteinkinaseCγisoform(PKCγ)immunoreactiveneuronsfromthemedullaryandspinaldorsalhornstothenucleusrapheobscurus(NRO)inrat．MethodsThedoublelabelingmethodof

2、fluorogold(FG)retrogradetracingbinedmunofluorescencehistochemicalstaininginaeⅠ—Ⅲofthemedullaryandspinaldorsalhorns.PKCγimmunoreactiveneuronsainlyobservedintheinnerpartoflaminaⅡandtheborderregionbetinaeⅡandⅢ，inaeⅠandⅢ，onlyafemunoreactiveneuronseFG1abeledneuro

3、nsinlaminaⅠofthemedullaryandlaminaeⅠ—ⅢofthespinaldorsalhornalsoexhibitedPKCγimmunoreactivity．ConclusionThepresentresultsindicatethatPKCγcontainingneuronsinthemedullaryandspinaldorsalhornsprojecttotheNRO，suggestingthatPKCγmightbeinvolvedinthetransmissionofnocic

4、eptiveinformationfromthemedullaryandspinaldorsalhornstotheNRO.［KEYedullarydorsalhorn;spinaldorsalhorn;fluoroimmunoassay;rats延髓背角和脊髓背角浅层(Ⅰ、Ⅱ层)是外周疼痛信息向中枢传递的门户，在疼痛信息的传递和调控过程中发挥着重要作用。中缝隐核接受延髓背角和脊髓背角上行投射神经元的传入信息，经整合后再启动下行抑制系统，对延髓背角和脊髓背角神经元发挥选择性抑制作用［1］。蛋白激酶C(PKC)是重要

5、的细胞内信号转导分子，在脊髓背角浅层主要定位于兴奋性神经元［2］，并参与外周伤害性信息的传递［3，4］。PKC的γ亚单位（PKCγ）是否只是存在于延髓背角和脊髓背角浅层向中缝隐核（NRO）的投射神经元中，至今缺乏形态学依据。本研究应用荧光金(FG)逆行追踪和PKCγ免疫荧光组织化学相结合的双标记方法，观察延髓背角和脊髓背角浅层内PKCγ阳性神经元向NRO的投射。1材料与方法1．1实验动物成年SD大鼠12只（180～230g），雌雄不拘。1．2实验方法1．2．1逆行追踪动物在戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/kg）麻醉下

6、，根据PAXINOS和）的微量注射器将0.15μL双蒸水配制的40g/LFG经压力缓慢注入NRO，注射时间15～20min，注毕留针10min。注射点的坐标为耳间线后3.72mm，中线深度10.60mm。1．2．2标本制备动物存活6～7d后，在戊巴比妥钠腹腔注射（100mg/kg）深麻醉下，经左心室插管至升主动脉，先用100mL生理盐水快速冲洗血液，再用500mL含40g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB0.1mol/L，pH7.4）灌注固定30min以上。灌注完毕立即取出脑干和脊髓，移入含300g/L蔗糖的PB内直至

7、组织块沉底（4℃）。将注射部位、脑干尾段和脊髓颈段做冷冻连续冠状切片，切片厚30μm，脑干尾段和脊髓颈段的切片隔3张取1张，分为4套收集于磷酸盐缓冲液（PBS0.01mol/L，pH7.4）内。将第1、2套切片分别裱于经明胶处理的载玻片上，用于FG注射区的范围和FG标记神经元分布的观察以及NISSL染色。1．2．3免疫组织化学染色将第3套切片经PBS充分漂洗后，行PKCγ的免疫荧光组织化学染色，具体步骤如下：①兔抗PKCγ血清（1∶1000，SantaCruz）中孵育48h（4℃）；②Biotin标记的羊抗兔IgG

8、血清（1∶200，Vector）室温孵育4h；③Avidin结合的TexasRed（1∶1000，Vector）室温孵育2h。各抗体或复合物的孵育液均用含体积分数为0.003TritonX100的PBS稀释。以正常兔血清代替兔抗PKCγ血清并孵育第4套切片，作阴性对照。上述各步骤间，均用PBS洗片3次，每次10min。裱片，干燥，甘油和PBS（1∶1）混