低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践

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1、低分子量鱼精蛋白介导的天花粉蛋白的抗肿瘤实践中药天花粉为葫芦科植物栝楼Trichosantheskirilo或双边栝楼T.rosthorniiHarms的根，具有清热生津、消肿排脓的功效，主要用于热病烦渴、肺热燥咳。天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是天花粉的主要有效成分，具有多种生物活性，而最引人注目的是其抗肿瘤活性，研究证明天花粉蛋白对胃癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤细胞有显著的抑制作用。它通过令肿瘤核糖体失活而抑制蛋白合成，从而杀灭肿瘤细胞。但是由于细胞膜的存在，只有少数脂溶

2、性、非极性或不带电的小分子可以跨膜自由扩散，而绝大部分生物大分子药物，如蛋白质，难以穿透细胞膜，无法进入细胞发挥疗效，这将限制TCS的推广应用。穿膜肽是一类富含精氨酸的多肽，它作为药物载体，不但能有效携带各类外源性大分子(如多肽、蛋白质、核酸，甚至为纳米粒子)进入细胞，且不影响所携带货物分子(Cargo)的生物活性。故本课题组通过蛋白重组技术，构建TCS的表达系统，并在其C端引入半胱氨酸作为修饰位点，通过化学偶联，将其与细胞穿膜肽低分子量鱼精蛋白(loolecularine，LMCF-7细胞、人子宫颈

3、癌HeLa细胞，均购于中科院上海细胞库。　　1.2药品与试剂二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亚砜(DMSO)、氯化钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钾、三羟甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、巯基乙醇(β-ME)、过硫酸铵、甘氨酸、琼脂粉、三乙胺、浓盐酸、氯化钠和咪唑(国药集团化学试剂有限公司);蛋白胨、酵母提取物(英国Oxoid公司);3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、异丙基-beta-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(美国Thermo公司);B

4、CA(bicinchoninicacid)蛋白浓度测定试剂盒、青霉素链霉素双抗(P-S双抗)、卡那霉素、四甲基乙二胺、胰酶消化液(上海碧云天生物技术研究所);Ellman试剂(上海沃凯生物技术有限公司);异硫氰酸荧光素(FITC，探索生物有限科技公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma-Aldrich公司);1640细胞培养基、澳洲血源胎牛血清(美国Gibco公司);实验用水为超纯水，其他试剂均为分析纯。　　1.3主要仪器Ni2+-NTA亲和层析树脂(美国Novagen公司);Pillipor

5、e公司);MutifugeX1R低温高速离心机(美国Thermo公司);PurifierUPC快速蛋白液相色谱(fastproteinliquidchromatography，FPLC)、肝素亲和色谱柱(美国通用电气公司);BT25S电子天平(德国赛多利斯科学仪器公司);LAB850酸度计(德国肖特股份有限公司);THZ-D台式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司);GelDocXR凝胶成像系统、Mini-protean蛋白电泳仪(美国伯乐公司);JY92-IIN超声波细胞破碎机(宁波新芝生物技术股份

6、有限公司)。　　1.4TCS重组蛋白的构建、表达通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)基因序列数据库，构建TCS的质粒，并以此为模板，在其3端插入10个天冬酰胺和1个半胱氨酸编码序列，并将此突变体命名为TCS-10N-C。经测序正确后，将TCS、TCS-10N-C的质粒转化E.coliBL21(DE3)菌株，涂布于含50μg/mL卡那霉素的固体培养基中过夜培养。次日挑取阳性克隆接种于1mL的LB培养液中(含卡那霉素50μg/mL)，37°C振摇培养至600nm的吸光度值(D值)为

7、0.6~0.8左右，按1∶100转接至新的LB培养基，37°C摇床扩充培养至600nm的D值为0.6~0.8左右，加入IPTG至终浓度为10mmol/L，室温诱导表达8h。8000r/min、4℃离心收菌，最后用F，室温避光反应4h。反应后加入10倍体积超纯水终止反应，以8000r/min离心20min，取上清过0.45μm微孔滤膜，用FPLC进行纯化。上样条件参考1.5项，上样后用100%A相冲平基线，再以1mL/min的流速，0~100%B相进行线性洗脱，收集电导率70ms/cm左右

8、出现的紫外吸收峰。样品收集后，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测定。　　1.7天花粉蛋白低分子量鱼精蛋白复合物(TCS-10N-SS-LMSO中，浓度为1mg/mL。按摩尔比为蛋白质∶FITC=1∶10的比例将FITC缓慢加入于蛋白溶液中，边加边轻轻晃动使其与蛋白混合均匀，暗处4°C反应8h。加入5mol/L的甘氨酸至终浓度50mmol/L，4°C终止反应2h。采用SephadexG50凝胶纯化，去除游离荧光素，制得FITC-TCS与FI