天花粉蛋白抗肿瘤作用的分子机理的研究

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1、浙江大学博士学位论文中文摘要天花粉蛋白抗肿瘤作用的分子机理研究浙江大学医学院肿瘤学博士研究生詹金彪导师郑树、王克夷、沈汉明中文摘要天花粉蛋白(trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝楼(TrichosantheskirilowiiMaxim)的块根中提取的一种蛋白质，为我国传统中药“天花粉”的有效成分，它具有引产、抗肿瘤和抗HIV病毒等多种生物学功能。TCS属于单链核糖体失活蛋白(ribosomeinactivatingprotein，RIP)，以往的研究主要集中在结构和药理作用方面，对其引起细胞凋亡和信号转导的分子机制研究得较少

2、。为了更好地进行临床应用，有必要对天花粉蛋白的抗肿瘤作用机理进行深入研究。研究目的通过现代细胞和分子生物学的方法，深入研究TCS引起的肿瘤细胞凋亡和信号转导过程的规律，揭示其抗肿瘤作用的分子机理。研究方法第一部分：天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响首先采用流式细胞术，以体外培养的鼠成纤维肉瘤细胞L929为对象，研究TCS对肿瘤细胞周期抑制作用；采用MTT法，在体外测定了TCS对Hela、Hep．G2、HCTll6、Col0205等肿瘤细胞的细胞毒性。为了证实Tcs引起细胞凋亡，利用Westernblot方法检测了细胞凋亡过程中Caspa

3、se3和其它信号分子如PARP和JNK的激活情况，以本实验室表达的TCS的类似蛋白PAP作为对照。第二部分：天花粉蛋白诱导细胞ERSTRESS作用研究为了研究TCS引起的内质网应激(ERStress)现象，首先采用Westernblot方法检测了TCSI起的内质网应激标志蛋白CHOP和BIP的表达，以及CHOP诱导TRAIL受体蛋白DR5的上调II浙江大学博士学位论文中文摘要情况；为了证明CHOP蛋白在TcS引起的细胞凋亡中的重要性，我们采用RNA干涉技术，将CHOPsiRNA转染进入L929细胞中以将CHOP基[习knock-down，观察

4、转染前后细胞对TCS和TRAIL的敏感性的差异，用流式细胞术和M'IT法测定TCS和TRAIL对上述两种细胞的协同杀伤作用。第三部分：AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究首先用Westernblot方法，检测了TCS诱导细胞自噬的标志蛋白LC3的转化现象，再用双荧光蛋白标记的．LC3质粒转化进入细胞，并用激光共聚焦显微镜观测了TCS处理下自噬体的形成现象，以本实验室表达的PAP作为对照；为了进一步研究自噬在TCS诱导凋亡过程中的重要性，我们采用RNA干涉技术，通过siRNA转染来分别knock．down与细胞自噬相关的基因At9

5、5、At97和Beclin，用Westernblot方法证实其表达水平；最后，用流式细胞术测定At95、At97和Beclin基因knock—down细胞对用TCS和TRAIL处理的敏感性，来确定自噬过程对TCS引起的细胞凋亡的重要性。研究结果：第一部分：天花粉蛋白对肿瘤细胞凋亡和周期阻滞的影响L929细胞经不同剂量TCS处理24hE，有明显的G0／G1期阻滞，并呈时间和剂量的依赖性，而当处理时间增Jjo至tJ48hE，高剂量组呈明显的s期细胞周期阻滞。MT／"试验证实，TCS对各种肿瘤细胞呈现细胞毒性作用，各种肿瘤细胞对TCS处理的敏感性不

6、同。用Hoechst33342和SytoxGreen染色经TCS处理的细胞可以在形态学上观察到细胞凋亡。TCS可以激活Caspase．3进而引起凋亡，PARP是Caspase．3的作用底物，因此能观察到PARP的的裂解，并呈时间和剂量依赖关系，对照蛋白PAP也有类似的作用。当培养基中加入泛Caspase抑制剂zVAD，可以完全阻断高剂量TCS处理Hela细胞引起的PARP的裂解，除见到PARP的裂解外，还可以见到Caspase．3酶原的激活和总JNK激酶的磷酸化激活。第二部分：天花粉蛋白诱导细胞ERSTRESS作用研究TCS可以引起L929细

7、胞的内质网应激，首先伴随着分子伴侣BIP的逐渐升高，在24hd"时后有内质网应激标志蛋白CHOP的明显表达，并观察到TRAIL受体DR5表达水平升高，Ill浙江大学博士学位论文中文摘要Caspase12酶原也是随着时间逐渐地被激活。因为TCS可以上调DR5的表达，所以在TCS和TRAIL联合应用时，呈现协同效应。用siRNA转染L929细胞后，CHOP基因knock．down细胞表现为对TRAIL和TCS联合处理的敏感性降低。第三部分：AUTOPHAGY参与天花粉蛋白诱导的凋亡过程研究微管相关蛋白1轻链3(microtubuleassocia

8、tedprotein1lightchain3，LC3)，是在真核细胞发现的自噬标志蛋白，Hela和L929细胞经TCS处理3～6h，用Westernblot可以见到