资源描述：
《中药复方921粗提物抗肿瘤作用机理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、中药复方921粗提物抗肿瘤作用机理研究作者：厉将斌,李洪燕,郭晓健,陈晓光,叶祖光,郭应禄【摘要】目的探索中药复方921粗提物抗肿瘤药效的作用机理。方法用大分子生物合成法、细胞周期法、WesternBlot法,检测中药复方921粗提物在体外对人前列腺癌细胞PC-3M生长抑制作用。结果中药复方921粗提物对肿瘤细胞的DNA合成有抑制作用,经72h作用后能将细胞阻滞于S期,并能诱导S期相关蛋白CyclinA表达下调。结论921方抗肿瘤作用的机理可能与抑制肿瘤细胞DNA合成、诱导CyclinA蛋白表达下调并进而导致细胞周期S期阻滞有关。【关键词】中药复方921；抗肿瘤
2、；机理研究Keywords：theextractsofprescription921；anticanceractivity；mechanismstudy921方[1]由龙葵、猪苓、莪术、女贞子、王不留行、补骨脂组成。在前期的实验中发现,其具有一定的体内和体外抗肿瘤药效[2],且毒性较小。为进一步了解其抗肿瘤作用机理,对其进行实验研究。 1实验材料7 1.1药物中药复方921,将莪术提取挥发油,药渣和猪苓、龙葵混合,水提并浓缩至稠膏；另取补骨脂、王不留行、女贞子用乙醇提取至稠膏；二者合并,混合、干燥、粉碎,制成颗粒,喷加入挥发油,密封包装,于阴凉干燥处保存。
3、 1.2细胞株、试剂前列腺癌PC-3M细胞株,北京大学泌尿外科研究所传代保存；RPMI1640培养基、胰酶,均为GIBCO产品；小牛血清,杭州四季青公司产品。3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)、3H-尿嘧啶核苷(3H-UR)、3H-亮氨酸(3H-Leu)均为中国原子能研究院产品。丽春红S(ponceanS)、SDSNa(十二烷基磺酸钠)、DTT、过硫酸胺(APS)、TEMED、聚丙烯酰胺(Acrylamide)、小牛血清白蛋白(BSA)、Tween20均为美国Sigma公司产品。NP-40、考马斯亮蓝G250为FLUKA公司产品。考马斯亮蓝R-250,英国进口分
4、装、中国医药公司北京采购供应站供应。TritonX-100由香港FARCO公司提供。苯甲基磺酰氟(PhenylmethylSulfonylFluoride,PMSF)为宝灵曼公司进口产品。琼脂糖(Agarose)为Promega公司产品。三羟甲基氨基甲烷(Tris)为Gibco公司进口。 1.3仪器7BeckmanLS-9800型液闪计数仪。COULTEREPICS-XL型流式细胞光度仪、碘化丙啶(propidiumiodide；PI)均为美国Sigma公司产品。 2实验方法 2.1DNA、RNA和蛋白质等大分子生物合成检测取对数生长期的人前列腺癌细胞PC
5、-3M,消化计数制成2×105/mL的细胞悬液,按每孔100μL接种于96孔板,置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。随后,加入100μL含不同浓度药液和溶剂对照的培养基,同时设空白对照组(不加细胞),每组平行3孔,置于培养箱继续培养12、24h。在终止作用前4h,每孔加入3H-TdR、3H-UR和3H-Leu,终浓度为1μCi/孔。4h后吸出含同位素标记的溶液,每孔加入0.25%胰酶60μL,于37℃消化30min。用自动细胞收集器将每孔细胞分别收集于玻璃纤维膜上,蒸馏水冲洗20次,取出膜,置于红外烤箱中80℃干烤15min,剪下膜片,分别置于经相应标记的
6、液闪瓶中(内装4mL闪烁剂、0.4%PPO和0.01%POPOP的二甲苯溶液),暗处放置15min后,用液闪计数仪测定每个样品的cpm值。 2.2细胞周期检测方法7取处于对数生长期的PC-3M肿瘤细胞,制成浓度为3×105/100mL培养瓶的细胞悬液。24h后分成4组,分别为对照组和高、中、低(贮存母液稀释度：1∶5、1∶10、1∶20)不同药物剂量组。分别于加药后24、48、72、96h,收集贴壁和悬浮细胞,离心后用4℃预冷1×PBS洗涤,再离心,经预冷1×PBS溶解后加入70%乙醇5mL固定过夜。离心去乙醇,用预冷1×PBS溶解,再次离心并溶解于0.5mL
7、Propidiumiodide染液(PI2μg/mL,RNase1mg/mL,Glucose1mg/mL,PBS1mL)中。置于4℃暗处染色反应1h。随后经300目筛过滤后上样,进行流式细胞仪检测。 2.3WesternBlot杂交分析蛋白表达方法用921方稀释液1∶5、1∶10、1∶20的不同浓度,分别作用于生长期细胞72h,提取收集全部细胞,提取总蛋白,用G-250法测定蛋白含量,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白,并用半干电转法将蛋白转移到硝酸纤维素膜上,随后用TTBS在4℃封闭非特异结合位点过夜,经一抗孵育、漂洗,二抗孵育后,与Western显色底物在
8、室温下反应10min,用
