大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞toll样受体2-4基因表达及受体反应性

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1、大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体2/4基因表达及受体反应性：杜权，王正国，朱佩芳，蒋建新，董蕻，刘庆【摘要】目的观察大鼠创伤后腹腔巨噬细胞Toll样受体(TLR)2/4基因表达及受体反应性变化。方法建立大鼠严重创伤(右侧胸部撞击伤复合双侧股骨闭合性骨折)模型，分别于创伤后2、6、12、24小时取腹腔巨噬细胞，以逆转录聚合酶联反应(RTPCR)测定TLR2/4的mRNA表达，以脂多糖(LPS)、Pam3CSK4刺激后取细胞上清液测定肿瘤坏死因子α(TNFα)水平。结果创伤后2小时腹腔巨噬细胞TLR2、TLR4的mRNA表达较正常对照组降低(P<0.05)，直至创伤

2、后24小时。行不同浓度LPS、Pam3CSK4刺激后细胞上清液TNFα水平较对照组降低(P<0.01)。结论严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4基因表达降低，受体反应性下降。【关键词】创伤;Toll样受体;肿瘤坏死因子;基因表达Abstract:ObjectiveTostudythegeneexpressionandreceptorreactivityofTolllikereceptor2and4onperitonealmacrophagesafterseveretraumainrats.MethodsTheseveretraumamodelofratspactinjurya

3、ndbilateralclosedfemurfracturesa,theexpressionofTLR2andTLR4mRNAonmacrophagesmacrophagesatedafterstimulationofLPSorPam3CSK4.ResultsAfterseveretrauma,theexpressionofTLR2andTLR4mRNA3CSK4mediatedTNFαaresultsindecreasedexpressionofTLR2andTLR4andimpairedresponsivenesstoLPSandPam3CSK4onmacrophages.　

4、　Keya;Tolllikereceptors;tumornecrosisfactor;geneexpression　　严重创伤后由于组织损伤产生大量的包括细胞因子在内的炎症介质以促进损伤恢复，如果反应过强可能导致全身炎症反应综合征(SIRS)、多器官功能障碍综合征(MODS),天然免疫在创伤后早期具有重要作用[1]。Toll样受体(TLR)2/4作为能分别识别G+菌成分和G-菌成分(LPS)的模式识别受体，主要分布于单核/巨噬细胞，在介导病原体相关分子模式(pathogenassociatedmolecularpatterns,PAMPs)引起的天然免疫中具有关键作用。Pam3

5、CSK4是一种合成性细菌脂蛋白，作为TLR2的配体，能活化促炎转录因子NFκB[2]。目前，关于单纯创伤后TLR2/4的变化研究较少，因而，本研究观察了大鼠严重创伤后腹腔巨噬细胞TLR2/4的基因表达及受体反应性变化。材料与方法　　1主要材料　　健康雄性I1640(HyClone,USA),细胞计数仪(SYSMEX,Japan),RNAout(天泽基因工程有限公司),LPS[E.coli(B4:O26)],Sigma),Pam3CSK4(InvivoGen,USA),紫外分光光度计(Du640,美国Beckman公司),TNFα试剂盒(晶美公司)。　　2动物及模型　　实验前夜动

6、物禁食12小时，不禁水。对照组不致伤，创伤组动物进行创伤后2、6、12、24小时作指标观察。创伤模型：乙醚麻醉后，动物仰卧位固定于鼠板，将鼠板左侧45°斜位，应用BIMⅢ型生物撞击机于吸气期撞击右侧4肋间腋前线，撞击后立即以止血钳折断双侧股骨中段造成闭合性骨折。　　3腹腔巨噬细胞的分离和培养　　3%戊巴比妥钠(150mg/kg)肌注后,经腹壁中线处向腹腔注射20ml左右4℃的磷酸盐缓冲液(PBS)，按摩腹部1~2分钟后用吸管从腹腔吸取液体，于离心管内离心1500r/min，10分钟。弃掉上清液，加入完全的RPMI1640培养基，用细胞计数仪计数。调整细胞密度为1×106/ml，接种

7、到培养板中，37℃孵育2小时。弃培养基后加入1mlRNAout以提取RNA或更换培养基，加入LPS、Pam3CSK4,其终浓度分别为10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml后继续孵育24小时后取上清液300μl,-70℃冻存，待测。　　4巨噬细胞TLR2、TLR4mRNA测定　　总RNA以紫外分光光度计测定其纯度和含量,取RNA样本0.5μg采用逆转录聚合酶链反应(RTPCR)检测TLR2、TLR4mRNA的表达。引物(上海生工合成)序列为：①T