乌司他丁对呼吸心跳骤停大鼠复苏早期脑组织谷氨酸代谢的影响

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1、乌司他丁对呼吸心跳骤停大鼠复苏早期脑组织谷氨酸代谢的影响-->前言（Introduction）心跳骤停（cardiacarrest,CA）是急救医学较常见的危重症之一，2010年国际心肺复苏(cardiopulmonaryresuscitation,CPR)指南将“生存链”增加一环，即CA后的治疗[1]，认为患者出现自主循环恢复(restorationofspontaneouscirculation,ROSC)只是CA后救治的开始而非终极目标,该环节的主要目的在于改善心功能和重要脏器的灌注,纠正代谢异常,实现神经系统功能的恢复。据统计，美国每天大

2、约有1200人发生院外心脏骤停，即使经过有效的CPR后患者ROSC，也有40%的患者到达医院后无意识恢复，而存活的清醒患者中约30%存在持久脑损伤，包括认知和运动功能的缺失。其主要原因是心跳骤停后引起的脑损害，循环停止4～6min即可出现不可逆神经损伤。心跳骤停后心肺脑复苏的病理生理基础是全身组织器官的缺血再灌注损伤(ischemiareperfusioninjury,I/R)过程。脑的缺血再灌注是一个快速的级联反应，包括能：能量代谢障碍、细胞内酸中毒、兴奋性氨基酸（Excitatoryaminoacid,EAAs）释放增加、细胞内钙失稳态、自由

3、基生成、凋亡基因激活等，这些环节互为因果，彼此重叠，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡或坏死。心肺脑复苏过程中ATP的恢复快慢直接关系到脑组织再灌注损伤的程度，在这一过程中，EAAs释放增加是脑损伤的始动因素，细胞外高浓度谷氨酸（Glutamate,Glu）与N-甲基-D天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartatereceptor,NMDAR）结合，引起大量胞外Ca2+内流，导致胞内钙超载，是引起脑损伤的共同通路。乌司他丁(ulinastatin,UTI)是1909年由Beuer和Reich在人尿液中发现的含有143个氨基酸的蛋白质，具有广

4、泛的抑酶谱，目前研究主要集中在乌司他丁对脑缺血再灌注中脑组织炎性介质和自由基影响方面，我们前期实验证实了乌司他丁对脑内能量代谢的有益影响，结果显示乌司他丁可在心肺脑复苏早期减少ATP的过度消耗，后期可迅速恢复ATP。由于神经兴奋性毒性与能量代谢密切相关，ATP减少，谷氨酸转运体功能障碍，细胞外谷氨酸蓄积，谷氨酸与相应受体结合（主要为NMDAR），引起与受体偶联的化学门控通道开放，使Ca2+大量内流，细胞内钙超载，从而引起神经细胞的凋亡或坏死。神经细胞的凋亡或坏死，又体现在患者认知和运动功能的缺失。因此，研究乌司他丁对呼吸心跳骤停大鼠复苏早期脑组织

5、兴奋性氨基酸代谢的影响具有重要意义。海马区是高级神经活动的重要部位，该区的神经细胞及神经胶质细胞对缺血的反应最敏感，因此本实验以海马区为研究对象，采用夹闭气管窒息的方法建立大鼠CPR模型，依据成模后药物干预方式不同，进一步探讨乌司他丁改善神经功能的可能机制，为临床试验提供实验依据。........材料与方法（Materials﹠Methods）1材料1.1实验动物成年的SD健康雄性大鼠189只，SPF级，体重280--320g，由新疆维吾尔自治区疾病控制中心动物研究所分批提供。购进后于兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科SPF级动物房饲养。室内温度2

6、2±5℃，湿度50±15%，每天的光照与黑暗时间各12小时。1.2主要实验试剂戊巴比妥钠上海化学试剂厂注射用乌司他丁广东天普生化医药有限公司谷氨酸标准品中国计量科学研究院AccQ•Fluor氨基酸衍生试剂盒美国枸橼酸盐缓冲液武汉博士德公司兔抗大鼠NMDAR多克隆抗体武汉博士德公司DAB显色试剂盒武汉博士德公司即用型SABC试剂盒武汉博士德公司3%H2O2北京中杉金桥生物有限公司甲苯胺蓝上海化学试剂厂无水乙醇上海化学试剂厂Fluo3-AM日本同仁化学生物有限公司Rho-123德国Merck公司DMSO日本同仁化学生物有限公司0.25%胰

7、蛋白酶上海Gibco生物有限公司D-Hank’s液德国Merck公司1640培养液美国Hyclone生物有限公司病理切片常规试剂：10%多聚甲醛、梯度酒精包括（70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%）、苏木素、伊红、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、中性树胶、1%盐酸酒精。（以上试剂由新疆兰州军区乌鲁木齐总医院动物科提供）透射电镜处理常规试剂：4%戊二醛磷酸缓冲液、1/15M磷酸缓冲液、梯度丙酮包括（50%、70%、80%、90%、100%Ⅰ、100%Ⅱ）、1/15M磷酸缓冲液、1%四氧化锇。（以上试剂由新疆医科大学基础研究教研室提供）2方法

8、2.1动物分组成年健康雄性SD大鼠189只，SPF级，体重280--320g，采用随机数字表法随机分为假手术对照组（S组），生理盐水复苏