tag1抗原hla

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1、TAG1抗原HLA栾琪，高天文，李春英，王刚，沈柱，党育平,李强　　【摘要】目的：对在恶性黑素瘤（MM）组织中表达率极高并具有强免疫原性的新型睾丸肿瘤（C/T）抗原TAG1表位的HLAA2限制性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位进行预测，并表达、纯化所预测表位与热休克蛋白70（Hsp70）融合蛋白，为特异性主动免疫治疗MM打下物质基础.方法：利用SYFPEITHI法和多项式方案结合预测TAG1的HLAA2限制性CTL表位，并将预测所得表位基因片断双串连后进行生物合成，克隆入带有GST标签并含Hsp70基因的原核表达载体，在IPTG诱导表达后，用G

2、ST蛋白纯化系统纯化.结果：预测并得到了三个TAG1的HLAA2限制性表位，成功地构建了表位与Hsp70的原核表达质粒（PGEXbHⅠ,HindⅢ和EcoRⅠ等内切酶均为TaKaRa公司产品；T4DNA连接酶为promega产品；大肠杆菌DH5α由第四军医大学西京医院皮肤科实验室保存；pGEX4T1Hsp70E7由西京医院皮肤科党育平博士构建.　　1.2方法　　1.2.1TAG1表位的远程预测利用Inte网络进入SYFPEITHI主页,对TAG1抗原HLA2A2限制性CTL表位进行远程预测〔3〕，再将所选表位进行限制性抗原肽多项式方案分析，即将

3、以上表位所有氨基酸残基对应的Ri〔4〕值相加,选择分值大于选定阈值的抗原肽为候选表位.本研究所选择阈值为-24.　　1.2.2候选表位基因片段序列的生物合成核酸序列合成由上海生物工程公司完成，序列上下游分别加入BamHⅠ,HindⅢ酶切位点残基（下划线部分），并将所预测表位九肽所对应核酸序列串连为双表位后进行合成，其单链序列如下：bol/L，各取2μL加入到46μL退火缓冲液中，放入盛有95℃水的烧杯中，让其自然冷却，以备连接使用.　　1.2.4融合基因原核表达载体的构建将pGEX4T1Hsp70E7经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，产物经10

4、g/L琼脂糖电泳后，回收4900bp质粒片段；取退火产物(带相应酶切位点粘性末端)1μL、回收质粒片断5μL,T4连接酶1μL、连接缓冲液1μL、去离子水2μL，于16℃连接过夜，常规转化DH5α，接种氨苄青霉素（Amp）阳性的LB平板后筛选阳性克隆，酶切鉴定，送测序证实.　　1.2.5融和基因在大肠杆菌中的表达将pGEXbL含100mg/LAmp阳性的LB培养液，37℃震荡培养过夜，取过夜菌1∶100接种500mLAmp阳性的LB培养液，37℃剧烈震荡（180r/min）培养至A600nm≈0.8，加入IPTG至终浓度为0.3mmol/L，2

5、8℃诱导表达4h.取1mL菌液留样，离心，去上清，加入100μLTE和100μL2×蛋白电泳Buffer，煮沸10min，行10%的SDSPAGE电泳鉴定.　　1.2.6表达蛋白的纯化将以上500mL培养液离心，沉淀重悬于25mL冰冷的STE液，加入100g/L溶菌酶25μL，冰浴15min，超声裂解细菌至菌液澄清后，4℃12000g离心15min，取上述裂解细菌上清，用0.45μm滤器过滤上清.采用10mLPBS平衡1mLGSTrap柱，0.5mL/min.将细菌裂解上清以0.5mL/min速度上样；采用10mLPBS清洗GSTrap柱，0.

6、5mL/min；用洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，分段收集，共收集6mL.SDSPAGE鉴定目的蛋白，-70℃保存.　　2结果　　2.1SYFPEITHI远程预测和多项式分析筛选出三个表位（Tab1）.表1TAG1的HLAA2限制性表位预测结果（略）　　2.2融合基因原核表达质粒的构建通过双表位肽段所对应核酸序列的退火，并与BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的pGEX4T1Hsp70E7连接，构建的融合质粒pGExbHⅠ和EcoRⅠ酶切后可见2020bp左右条带，与Hsp70加表位序列大小一致（Fig1），经测序Hsp70和表位基因片段均正确，说明表位和H

7、sp70融合载体构建成功.　　2.3融合蛋白的诱导表达和纯化经IPTG诱导后，表达Mr约98×103的蛋白（包括GST部分）；表位与Hsp70融合蛋白大多以包含体形式存在.但实验中，调整诱导表达时间至4h，温度28℃和IPTG终浓度为0.3mmol/L，可显著提高可溶性蛋白的表达水平.经分离纯化后得到了Mr约98×103可溶性蛋白（Fig2）.　　3讨论　　MM因其恶性程度高、易转移的特点，目前临床的治疗尚无良法.TAG1作为一种新型的C/T抗原，具有强免疫原性，因此，TAG1可能是非常理想的MM疫苗候选抗原〔1〕.有效的表位预测和鉴定方法可大

8、大提高寻找CTL表位的效率，利用Inte网上提供的数据库(.unituebingen.de/uni/kxi和.hcpep)对蛋白表位进行预测，然后利用