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1、MicroRNA155通过下调清道夫受体表达抑制巨噬细胞泡沫化形成尚菲曾德意杨慧黄琳燕刘捷吕晓飞关永源周家国【摘要】【目的】探讨microRNA-155(miR-155)对巨噬细胞泡沫化过程的影响及机制?【方法】实时定量PCR检测miR-155的表达,iR-155通过降低巨噬细胞SR-A和CD36的表达抑制巨噬泡沫细胞的形成?【关键词】miR-155;动脉粥样硬化;THP-1巨噬细胞;清道夫受体;泡沫化 Abstract:【Objective】TostudytheeffectofmicroRNA-155(miR-155)onmacr
2、ophagicfoamcellformation.【Methods】Real-timeRT-PCRicroRNA-155.I-1640培养液?L-谷氨酰胺?青霉素及链霉素均购于美国Hyclone公司;M199培养液?胎牛血清?胰蛋白酶为Gibco公司产品,MTT(四甲基偶氮唑盐)及DMSO(二甲基亚砜)为美国Sigma公司产品,实验用水为超纯水?人肝癌细胞株HepG2由本科室保存,人脐静脉内皮细胞(HUVEC)为原代分离培养?动态激光散射仪(BI9000AT)为美国Brookhaven公司产品;紫外-可见分光光度计(Lambda45)
3、为美国PerkinElmer公司产品;透射电子显微镜(TEAI10)为Philips公司产品;全波长多功能酶标仪(safireⅡ)为美国Bio-Rad公司产品;相关酶标板为Costar酶标板? 1.2AuNP的合成及鉴定 我们采用氯金酸还原法,即利用柠檬酸将氯金酸中的Au+3还原为Au0?合成所用器皿均经过王水处理,5mL柠檬酸钠(38.8mmol/L)加入煮沸的50mL氯金酸(1mmol/L)溶液中,用力搅拌过夜,溶液变为葡萄酒色,AuNP即合成?冷却至室温,用0.22μm滤器过滤,于4℃在玻璃瓶中保存备用;利用透射电子显微镜(
4、TEM)和紫外-可见分光光度计(UV-Vis)对其进行鉴定? 1.3EPI-AuNP复合体的合成 取合成后的AuNP溶液4mL,用超纯水稀释至8mL,用1mol/LNaOH溶液调pH为8.0(根据预实验结果),然后加入一定浓度的EPI溶液2mL?置于恒温空气摇床(120r/min)37℃过夜?然后20000r/min(r=6.4)离心40min,弃去上清液,用0.01mol/LPB液冲洗3次?重复离心?冲洗3次后将制备的EPI-AuNP重悬于0.01mol/LPB液中备用? 1.4EPI-AuNP复合体的鉴定 取相同浓度AuN
5、P?EPI-AuNP溶液:①动态激光散射仪(DLS)对其粒径变化进行检测;②Zeta电位仪检测其Zeta电位变化;③紫外-可见分光光度计(UV-Vis)对其吸收光谱进行检测?另外,利用全波长多功能酶标仪(safireⅡ)(激发波长500nm,发射波长560nm)对相同浓度EPI?EPI-AuNP溶液的荧光强度进行检测? 1.5EPI-AuNP复合体对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的影响 1.5.1〓HUVEC的分离培养〓取本医院产科健康产妇足月顺产或剖宫产的脐带,长度>20cm,无菌条件下用PBS缓冲液洗净血迹,将脐静脉两端
6、夹闭后管腔内注入2.5g/L胰酶进行消化,10min后收集脐静脉消化液,1000r/min(r=16.1cm)离心10min,轻轻弃去上清液,将HUVEC重悬于完全培养基(M199+100mL/L胎牛血清),37℃?体积分数5%CO2培养箱培养?根据细胞生长情况,2~3d换液1次?传代至第3代时进行以下实验? 1.5.2〓MTT比色法检测各组HUVEC的生存率〓实验分为AuNP处理组?EPI处理组?EPI-AuNP处理组和空白对照组,每组设6个复孔?HUVEC以5×103个/孔接种于96孔板,培养24h后各组分别加入1μg/LAuN
7、P?2mg/LEPI?含2mg/LEPI的EPI-AuNP溶液和无血清培养液200μL,继续培养24h?实验终止前4h,每孔加入0.5%MTT溶液20μL?4h后弃去上清液,加入DMSO150μL/孔?用多功能酶标仪(测量波长570nm,参比波长630nm)测吸光度(A)值,细胞生存率(%)=(实验组A值/对照组A值)×100%,以上实验重复3次? 1.5.3〓紫外-可见分光光度计(UV-Vis)检测HUVEC内EPI的积聚量〓实验组分为EPI处理组和EPI-AuNP处理组,每组设6个复孔?将HUVEC以1×105个/孔种于6孔板?
8、培养24h后各组分别加入EPI溶液(10mg/L)和EPI-AuNP溶液(含相同浓度EPI)1mL?继续培养2h后将细胞用胰酶消化,移入1.5mLEP管中,离心(2000r/min,r=15.9min),0.1mol/L
