hbsag-hccag融合表达细胞系的建立

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1、HBsAg/HCcAg融合表达细胞系的建立摘要:目的建立融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的体外培养细胞系，使之作为细胞杀伤实验的靶细胞.方法将含HBVS和HCVC融合基因真核表达质粒CSpcD-NA3.1用电穿孔法转染p815细胞，G418筛选后，再用有限稀释法进行单细胞克隆筛选.RT-PCR与免疫荧光法分别检测基因转录与蛋白表达.结果HBVS基因与HCVC基因的RT-PCR检测均为阳性，HBV表面抗原与HCV核心蛋白的免疫荧光检测均为阳性.结论成功获得融合表达HBV表面抗原与HCV核心蛋白的细胞系.　　Keyericp

2、lasmidCSpcDNA3.1includingHBVSgeneandHCVCgene.Clones-iteddilution.HBVSgeneandHCVCgene-munofluorescentassay.RESULTSTranscriptionofHBVSgeneandHCVCgeneed.HBsAgandHCcAgega公司.RPMIMedium1640培养基、HBV表面抗原单克隆抗体、HCV核心蛋白单克隆抗体及荧光标记的羊抗鼠单克隆抗体均购于华美生物工程公司.电穿孔仪（GenePulserⅡElectroporat

3、ionsystem）为BIO-RAD公司产品.　　1.2方法　　1.2.1G418浓度与电穿孔参数的选择在六孔板上培养p815细胞，待铺满板底25%面积时，加入G418，六孔终浓度分别为0，200，300，400，500，600mg・L-1，观察细胞成活率，2～3L1×HEBESpH7.3洗涤1次，沉淀重悬于2mL1×HEBES液中，取2份0.8mL于2个电穿孔杯中，分别加入线性化质粒CSpcD-NA3.1和pcDNA3.1，于4℃冰箱10min.电传条件950μF，230V和17.0ms.电穿后移入六孔板，加2

4、.2mL100mL・L-1RPMI1640培养液混匀，G418终浓度为400mg・L-1.2～3RNA的检测Trizol法提取RNA后，用DNaseⅠ处理RNA样品.RT-PCR参照AMVReversetranscriptionKIT说明书进行.　　1.2.5HBsAg和HCcAg的检测培养上清用ELISA方法检测，培养细胞用免疫荧光法检测.收集细胞，调整细胞密度为5×109・L-1，各取40μL细胞悬液加入两个小玻璃管内，再加抗HBsAg或抗HCcAg的抗体和1∶20稀释的正常兔血清

5、50μL，4℃30min;用DPBS洗涤2次，1000r・min-1离心5min，弃上清，加入1∶10稀释的羊抗鼠荧光标记物50μL和1/104的伊文蓝2μL，4℃30min;同上离心洗涤，加100μL固定液，制片后在荧光显微镜下观察.转染pcDNA3.1的阴性细胞对照检测方法同上.　　2结果　　2.1G418最适浓度和最佳电传孔条件600和500mg・L-1孔于第2日，400和300mg・L-1孔于第3日，200mg・L-1于第5日开始分别出现抑制现象，细胞开始溶解.其

6、中300mg・L-1和400mg・L-1两孔培养细胞分别在第18日和第16日全部死亡，为克隆筛选的最适G418浓度.p815细胞经电穿孔后，过夜后观察活细胞计数，80%细胞死亡的电传条件为950μF，230V和17.0ms，为最佳电传孔参数.　　2.2G418筛选结果G418筛选转染的p815细胞，3wk后细胞开始稳定生长，不再有细胞死亡.ELISA检测细胞培养上清，HBsAg和HCcAg均为阴性;免疫荧光法检测，HBsAg和HCcAg均只有约50%的细胞为阳性.　　2.3转染后阳性表达的RT┐PC

7、R鉴定G418筛选后，逆转录再PCR扩增，HBVS片段与HBVS+HCVC片段均为阳性，两片段各约为670bp和1240bp，扩增的大小正确（Fig1，2）.　　3讨论　　目前HBV与HCV都没有合适的细胞与动物感染模型，因此要建立HBV与HCV抗原特异性的靶抗原，只能借助体外转染技术.国内外学者先后有将HBVS基因或HCVC基因单独转染细胞的报道［5］，但应用较为局限.我们将含HBVS和HCVC基因的融合真核表达质粒CSpcDNA3.1用电穿孔法导入p815细胞，经G418筛选，有限稀释法再筛选，获得了融合表达HBsAg/H

8、CcAg的细胞克隆.该转染细胞系不仅可以作为HBVS基因或HCVC基因免疫后的CTL杀伤实验的靶细胞，而且同时可以作为HBVS与HCVC融合基因免疫后的CTL杀伤实验的靶细胞，从而可用于检测融合基因免疫动物后效应细胞对靶细胞的累加杀伤效果.　　　　　图3－图5略　　载体的性质